Tiêu\r\nchuẩn này áp dụng cho việc xác định, kiểm tra mật độ và hoạt tính đối kháng của\r\ncác vi sinh vật đối với nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn (cây hàng năm)
\r\n\r\n\r\n\r\n2.1.
- Có khả\r\nnăng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển hay làm mất hoặc giảm độc tính gây\r\nbệnh vùng rễ cây trồng
\r\n\r\n- Tạo\r\nđược vòng đối kháng (vòng tròn trong suốt) bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc\r\ncủa vi sinh vật đó khi tiếp xúc với nấm bệnh trên môi trường nuôi cấy nhân tạo
\r\n\r\n- Làm\r\ngiảm được tỷ lệ bệnh do nấm gây ra trên cây chủ
\r\n\r\n2.2. Hoạt\r\ntính đối kháng của vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng
3.1. Xác\r\nđịnh hoạt tính đối kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm
\r\n\r\n3.1.1.\r\nThiết bị và dụng cụ
\r\n\r\n3.1.1.1.\r\nThiết bị khử trùng:
\r\n\r\n| \r\n - Nồi hấp khử\r\n trùng: Áp suất tối thiểu 1 at (tương đương nhiệt độ khử trùng 1210C) \r\n | \r\n
| \r\n - Tủ sấy: Nhiệt độ từ 40 đến 2600C \r\n | \r\n
3.1.1.2. Thiết bị nuôi cấy vi\r\nsinh vật:
\r\n\r\n| \r\n - Tủ ấm: Nhiệt độ tối đa 600C \r\n | \r\n
| \r\n - Tủ ấm lạnh: Nhiệt độ 20- 600C \r\n | \r\n
| \r\n - Buồng cấy vô\r\n trùng \r\n | \r\n
| \r\n - Máy lắc ổn nhiệt:\r\n Tốc độ 150 vòng/phút, nhiệt độ tối đa 600C \r\n | \r\n
3.1.1.3.\r\nThiết bị đo lường:
\r\n\r\n| \r\n - Cân phân tích\r\n (d=0,001) \r\n | \r\n
| \r\n - Cân kỹ thuật\r\n (d=0,1) \r\n | \r\n
| \r\n - Máy đo pH \r\n | \r\n
| \r\n - Máy đếm khuẩn lạc \r\n | \r\n
| \r\n - Micropipet:\r\n 50-200µl; 200-1000µl; 500-5000µl \r\n | \r\n
3.1.1.4.\r\nMáy cất nước 2 lần
\r\n\r\n3.1.1.5.\r\nDụng cụ thuỷ tinh:
\r\n\r\n| \r\n - Bình tam giác:\r\n 100, 250, 500 ml \r\n | \r\n
| \r\n - Cốc thuỷ tinh:\r\n 100, 250, 500,1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n - Cốc định lượng:\r\n 50, 100, 500 ml \r\n | \r\n
| \r\n - Petri: đường kính\r\n 90mm \r\n | \r\n
| \r\n - Ống nghiệm:\r\n 18x180mm \r\n | \r\n
3.1.2.\r\nMôi trường nuôi cấy và hoá chất khác
\r\n\r\n3.1.2.1.\r\nMôi trường nuôi cấy
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường PDA
\r\n\r\n- Môi trường\r\nThạch-Thịt-Pepton
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường Czapek
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường Gauze
\r\n\r\n3.1.2.2.\r\nHoá chất khác
\r\n\r\n| \r\n - | \r\n
| \r\n - NaOH \r\n | \r\n
| \r\n - Kháng sinh\r\n (Streptomycin, Rifamycin, Spectamycin) \r\n | \r\n
3.1.3.\r\nChuẩn bị
\r\n\r\n3.1.3.1. Khử trùng dụng cụ\r\nvà đất
\r\n\r\n- Các dụng cụ sử dụng\r\ntrong nuôi cấy, nhiễm vi sinh vật và xác định hoạt tính của vi sinh vật phải\r\nđược khử trùng bằng 1 trong 2 cách: Sấy ở nhiệt độ 1800C không ít\r\nhơn 1 giờ trong tủ sấy hoặc giữ ở áp suất 1,0 atmotphe (tương đương1210C)\r\nkhông ít hơn 30 phút trong nồi hấp khử trùng
\r\n\r\n- Đất được sử dụng trong\r\nphép thử nghiệm trên cây trồng được giữ ở áp suất 1,5 atmotphe không ít hơn 1\r\ngiờ trong nồi hấp khử trùng
\r\n\r\n3.1.3.2. Dịch vi sinh vật
\r\n\r\na. Dịch nấm bệnh vùng rễ
\r\n\r\n- Cấy giống: Lựa chọn những\r\nbào tử của chủng nấm bệnh có độc tính đã được kiểm tra khả năng gây bệnh vùng\r\nrễ cây trồng, cấy chuyển vào môi trường PDA. Nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa\r\ntrong thời gian 3-5 ngày ở nhiệt độ 28-300C cho đến khi bào tử nấm\r\nmọc đầy trên đĩa thạch
\r\n\r\n- Pha mẫu: Dùng que cấy vô\r\ntrùng lấy bào tử nấm bệnh đưa vào ống nghiệm thuỷ tinh đã chứa 5ml nước cất vô\r\ntrùng, trộn đều bằng thiết bị lắc cơ học
\r\n\r\nb. Dịch vi sinh vật đối\r\nkháng
\r\n\r\nVi sinh vật đối kháng được\r\nnuôi cấy trong môi trường (xem phần phụ lục) ở điều kiện nhiệt độ, pH và\r\nthời gian thích hợp với từng loài sao cho mật độ sau nuôi cấy đạt 108-1010CFU/ml
\r\n\r\n3.1.4.\r\nTiến hành
\r\n\r\n3.1.4.1. Cấy mẫu nấm bệnh
\r\n\r\n- Dùng micropipet vô trùng\r\nhút 0,10ml dịch nấm bệnh (phần a mục 3.1.3.2) cấy vào đĩa petri chứa 30ml môi\r\ntrường PDA (lớp thạch thứ nhất) đã chuẩn bị sẵn
\r\n\r\n- Lắc nhẹ đĩa petri cho\r\ndịch nấm bệnh tràn đều trên bề mặt thạch, dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến\r\nkhi dịch nấm bệnh thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch. Chú ý không để dịch nấm\r\nbệnh dính vào thành đĩa petri
\r\n\r\n- Sau khi bề mặt thạch khô\r\n(khoảng 4 giờ), phủ tiếp 20 ml môi trường thích hợp phụ thuộc vào vi sinh vật\r\nđối kháng (lớp thạch thứ hai) lên lớp thạch thứ nhất đã cấy nấm bệnh.\r\nCác đĩa thạch được để khô trong 45 phút. Lưu ý: nhiệt độ của môi trường khi phủ\r\nlên trên lớp thạch thứ nhất từ 350 đến 450C, độ dày của\r\nlớp thạch thứ hai dày 2 đến 3mm
\r\n\r\n- Mỗi mẫu lặp lại 3 lần
\r\n\r\n3.1.4.2. Cấy mẫu vi sinh\r\nvật đối kháng
\r\n\r\na. Pha loãng mẫu
\r\n\r\n- Dùng micropipet vô trùng\r\nlấy ra 10ml dịch vi sinh vật đối kháng đưa vào bình thuỷ tinh chứa 90ml dung\r\ndịch muối sinh lý vô trùng (0,85% NaCl trong nước cất), trộn đều bằng thiết bị\r\ntrộn cơ học
\r\n\r\n- Dùng micropipet vô trùng\r\ntiếp tục lấy 1ml dịch cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng,\r\ntrộn đều bằng thiết bị lắc cơ học. Quá trình này được lặp lại cho đến khi được\r\ndịch vi sinh vật đối kháng có mật độ thích hợp có thể đếm được khuẩn lạc trên\r\nđĩa thạch
\r\n\r\nb. Cấy mẫu
\r\n\r\nDùng micropipet vô trùng\r\nhút 0,05ml dịch vi sinh vật đối kháng (phần a mục 3.1.4.2) cấy vào lớp thạch\r\nthứ hai. Lắc nhẹ đĩa petri cho dịch vi sinh vật đối kháng tràn đều trên bề mặt\r\nthạch, dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch vi sinh vật đối kháng\r\nthấm hoàn toàn trên bề mặt lớp thạch thứ hai. Chú ý không để dịch vi sinh vật\r\nđối kháng dính vào thành đĩa petri. Các đĩa thạch được nuôi cấy giữ ở điều kiện\r\nnhiệt độ và thời gian thích hợp
\r\n\r\n3.1.5.\r\nĐọc kết quả
\r\n\r\nHoạt tính đối kháng của vi\r\nsinh vật đối kháng được thể hiện thông qua vòng đối kháng (vòng tròn trong suốt\r\nbao quanh khuẩn lạc của vi sinh vật đối kháng), được tính bằng trung bình cộng\r\ngiá trị kích thước vòng vô khuẩn của 3 lần lặp lại, biểu thị bằng công thức:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\n- D là đường kính vòng vô\r\nkhuẩn (mm)
\r\n\r\n- d là đường kính\r\nkhuẩn lạc (mm)
\r\n\r\nSố lượng tế bào vi sinh\r\nvật có hoạt tính đối kháng trong 1ml dịch được thể hiện thông qua số lượng\r\nkhuẩn lạc tạo được vòng đối kháng bao quanh khuẩn lạc và được tính bằng công\r\nthức:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\n- A là số lượng vi sinh\r\nvật đối kháng/ml
\r\n\r\n- a là số lượng khuẩn lạc\r\ncó vòng đối kháng
\r\n\r\n- c là tỉ lệ nghịch đảo\r\ncủa nồng độ pha loãng
\r\n\r\n-
3.2. Xác\r\nđịnh hoạt tính đối kháng trên cây trồng
\r\n\r\n3.2.1.\r\nDụng cụ, thiết bị, vật tư
\r\n\r\n- Dụng cụ và thiết bị: Như\r\nmục 3.1.1.
\r\n\r\n- Vật tư: Đất trồng, hạt\r\nhoặc củ giống, phân bón, nước vô trùng, v.v...
\r\n\r\n3.2.2.\r\nChuẩn bị vật liệu
\r\n\r\n3.2.2.1. Đất trồng, hạt\r\ngiống, phân bón
\r\n\r\n- Thử nghiệm được tiến\r\nhành trên đất khử trùng tơi xốp, có hàm lượng hữu cơ không nhỏ hơn 1,5% và pH\r\ntừ 6,0 đến 6,5. Đất trồng được đựng trong các chậu vại hoặc khay với lượng đất\r\nphù hợp cho từng đối tượng cây chủ
\r\n\r\n- Hạt hoặc củ giống sử\r\ndụng là hạt hoặc củ giống sạch, giống mẫn cảm và được khử trùng bề mặt bằng\r\ndung dịch 4% H2O2
\r\n\r\n- Phân bón được sử dụng\r\nvới liều lượng và chủng loại theo qui trình chung đối với từng loại cây trồng
\r\n\r\n3.2.2.2. Dịch vi sinh vật
\r\n\r\na. Dịch nấm gây bệnh
\r\n\r\n- Nấm gây bệnh được nuôi\r\ncấy trên môi trường thạch đĩa (môi trường PDA). Chọn những ống giống thuần, cấy\r\ntruyền trên môi trường thạch đĩa PDA và nuôi ở nhiệt độ 28-300C.\r\n
\r\n\r\n- Sau 4-5 ngày, chuyển\r\ntoàn bộ sinh khối từ đĩa thạch vào 5ml nước cất vô trùng; trộn đều để đạt được\r\nmật độ 108CFU/ml.
\r\n\r\nb. Dịch vi sinh vật đối\r\nkháng
\r\n\r\nVi sinh vật đối kháng được\r\nchuẩn bị theo phần b mục 3.1.3.2
\r\n\r\n3.2.3.\r\nTiến hành thử nghiệm
\r\n\r\n3.2.3.1. Bố trí thử nghiệm
\r\n\r\n- Thử nghiệm được tiến\r\nhành với 2 công thức: Đối chứng (nhiễm nấm bệnh), thí nghiệm (nhiễm hỗn hợp vi\r\nsinh vật đối kháng với nấm bệnh). Mỗi công thức được lặp lại không ít\r\nhơn 3 lần với tổng số cây ít nhất là 50 cây
\r\n\r\n- Thí nghiệm được thực\r\nhiện trong buồng sinh trưởng, bảo đảm hạn chế tối đa ảnh hưởng của các yếu tố\r\nphi thí nghiệm
\r\n\r\n3.2.3.2. Tiến hành thử\r\nnghiệm
\r\n\r\n- Vi sinh vật đối kháng\r\nđược nhiễm vào đất trước khi gieo trồng với mật độ vi sinh vật 10 8CFU/ml\r\nđối với công thức thí nghiệm
\r\n\r\n- Ngâm hạt hoặc củ giống\r\ntrong dịch nấm bệnh mật độ 10 8CFU/ml đã được chuẩn bị trong thời\r\ngian 30 phút
\r\n\r\n- Gieo trồng hạt hoặc củ\r\nđã nhiễm nấm bệnh vào đất vô trùng đối với công thức đối chứng và đất đã được\r\nnhiễm vi khuẩn đối kháng đối với công thức thí nghiệm
\r\n\r\n- Thí nghiệm được chăm sóc\r\ntheo qui trình phù hợp với từng đối tượng cây chủ;
- Trong thời gian 30-45\r\nngày kể từ khi gieo trồng, phải quan sát và ghi nhận hàng ngày tình trạng sức\r\nkhoẻ của cây trồng (không có triệu chứng bệnh hoặc có triệu chứng bệnh)
\r\n\r\n3.2.4.
Tỉ lệ cây bệnh được tính\r\ntheo công thức:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n x 100 \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n
So sánh tỷ lệ cây bị bệnh giữa công thức thí nghiệm với\r\ncông thức đối chứng và đánh giá hoạt tính đối kháng của vi sinh vật theo các\r\ncấp độ sau:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
B.1. Môi\r\ntrường nuôi cấy nấm bệnh
\r\n\r\nThành\r\nphần môi trường PDA (gam/lít)
\r\n\r\n| \r\n - Dextrose: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - Khoai tây: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - Thạch: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - pH: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Ghi chú:
\r\n\r\n- Khoai tây thái nhỏ, cho vào 1 lít nước và đun sôi trong\r\n20 phút, sau đó lọc lấy nước trong để sử dụng làm môi trường
\r\n\r\n- Bổ sung 0,2% kháng sinh trong 100 ml môi trường đã khử trùng trước khi đổ ra đĩa\r\npetri
\r\n\r\nB.2. Môi\r\ntrường nuôi cấy vi sinh vật đối kháng
\r\n\r\n- Trong\r\ntrường hợp đã biết rõ loài vi sinh vật đối kháng cần xác định, môi trường được\r\nsử dụng để nuôi cấy là môi trường đặc hiệu hoặc môi trường có thành phần thích\r\nhợp cho sự sinh trưởng phát triển của loài vi sinh vật đã biết.
\r\n\r\n- Trường\r\nhợp chưa biết chính xác vi sinh vật cần xác định thì lựa chọn một trong các môi\r\ntrường nuôi cấy như sau:
\r\n\r\nB.\r\n2.1.Môi trường cho vi khuẩn: Môi trường Thạch-Thịt-Pepton
\r\n\r\nThành\r\nphần môi trường (gam/lít):
\r\n\r\n| \r\n - Pepton: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - Cao thịt: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - Thạch: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - Nước cất: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - pH: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
(pH môi\r\ntrường được điều chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
\r\n\r\nB.2.2.\r\nMôi trường nuôi cấy nấm: Môi trường Czapek
\r\n\r\nThành\r\nphần môi trường (gam/lít):
\r\n\r\n| \r\n - NaNO3 : \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - Sacaroza: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - KH2PO4\r\n : \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - MgSO4.7H2O: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - Thạch: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - Nước cất: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - pH: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
(pH môi\r\ntrường được điều chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
\r\n\r\nB.2.3.\r\nMôi trường cho xạ khuẩn: Môi trường Gauze
\r\n\r\nThành\r\nphần môi trường (gam/lít):
\r\n\r\n| \r\n - Tinh bột tan: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - KNO3: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - KH2PO4\r\n : \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - MgSO4.7H2O: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - NaCl: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - FeSO4: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - Thạch: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - Nước cất: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n - pH: \r\n | \r\n \r\n | \r\n
(pH môi\r\ntrường được điều chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
\r\n\r\nNgoài ra\r\ntrong điều kiện hạn hẹp có thể sử dụng môi trườ
File gốc của Tiêu chuẩn ngành 10TCN 867:2006 về vi sinh vật – Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn ngành 10TCN 867:2006 về vi sinh vật – Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | 10TCN867:2006 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn ngành |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2006-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |