\r\n\r\n
TIÊU CHUẨN\r\nNGÀNH
\r\n\r\n
10 TCN\r\n445:2001
\r\n\r\n
PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA
\r\n\r\n
PHÂN VI SINH VẬT KỊ KHÍ CỐ ĐỊNH NITƠ\r\nVÀ PHÂN GIẢI XENLULO
\r\n\r\n
Anaerobic nitrogen fixing\r\nand cellulotic degradating biofertylizer
\r\n\r\n
Method for quality\r\ncontrol
\r\n\r\n
Ban hành kèm theo\r\nquyết định số: 16-2001/QĐ-BNN-KHCN ngày 23 tháng 2 năm 2001 của Bộ Nông nghiệp\r\nvà Phát triển nông thôn.
\r\n\r\n
1.\r\nPhạm vi áp dụng:
\r\n\r\n
Tiêu chuẩn này áp\r\ndụng cho việc kiểm tra mật độ các vi sinh vật có khả năng cố định nitơ hoặc\r\nphân giải xenlulo kị khí trong phân bón vi sinh vật.
\r\n\r\n
2.\r\nThuật ngữ, định nghĩa:
\r\n\r\n
2.1. Phân vi sinh vật\r\n(gọi tắt là phân vi sinh) là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống\r\nhữu ích đã được tuyển chọn có mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành thông qua\r\ncác hoạt động sống của chúng trong đất tạo nên chất dinh dưỡng mà cây trồng có\r\nthể sử dụng được (N, P, K) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng\r\nsuất và chất lượng nông sản. Phân vi sinh vật không gây ảnh hưởng xấu đến chất\r\nlượng nông sản, người, động vật, thực vật và môi trường sinh thái.
\r\n\r\n
2.2. Phân vi sinh vật\r\nkị khí cố định nitơ là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống, đã\r\nđược tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành, có khả năng cố định\r\nnitơ trong điều kiện kị khí, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất lượng\r\nsản phẩm. Các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, động vật,\r\nthực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
\r\n\r\n
2.3. Phân vi sinh vật\r\nkị khí phân giải xenlulo là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống,\r\nđã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành, có khả năng phân\r\ngiải xenlulo trong điều kiện kị khí, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất\r\nlượng sản phẩm. Các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, động\r\nvật, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
\r\n\r\n
2.4. Vi sinh vật đã\r\nđược tuyển chọn là vi sinh vật đã được nghiên cứu, đánh giá hoạt tính sinh học\r\nvà hiệu quả đối với đất, cây trồng dùng để sản xuất phân vi sinh vật.
\r\n\r\n
2.5. Vi sinh vật tạp là\r\nvi sinh vật có sẵn trong phân vi sinh vật nhưng không thuộc loại vi sinh vật đã\r\nđược tuyển chọn.
\r\n\r\n
3.\r\nNội dung, phương pháp:
\r\n\r\n
3.1. Trang thiết bị:
\r\n\r\n
- Tủ sấy (thiết bị\r\ntiệt trùng khô) và nồi hấp áp lực (thiết bị tiệt trùng ướt)
\r\n\r\n
- Tủ ấm
\r\n\r\n
- Tủ cấy vô trùng
\r\n\r\n
- Cân kỹ thuật có độ\r\nchính xác tới 0,01g
\r\n\r\n
- Que cấy
\r\n\r\n
- Que gạt thủy tinh
\r\n\r\n
- ống nghiệm thủy\r\ntinh
\r\n\r\n
- ống đong
\r\n\r\n
- Bình tam giác
\r\n\r\n
- Đĩa petri (hộp\r\nlồng)
\r\n\r\n
- Pipet chia độ,\r\npipetman
\r\n\r\n
- Đèn cồn hoặc đèn\r\ngas
\r\n\r\n
- Dụng cụ lấy mẫu\r\nphải là loại thép không gỉ hoặc bằng thuỷ tinh.
\r\n\r\n
- Dụng cụ nuôi cấy kị\r\nkhí: có thể sử dụng một trong các dụng cụ sau:
\r\n\r\n
+ Tủ nuôi kị khí
\r\n\r\n
+ Bình chân không
\r\n\r\n
+ Bình nuôi kị khí:\r\nGas Pak
\r\n\r\n
3.2. Tiến hành:
\r\n\r\n
3.2.1. Chuẩn bị dụng\r\ncụ:
\r\n\r\n
Các dụng cụ lấy mẫu\r\nvà dụng cụ dùng trong xác định vi sinh vật phải tiệt trùng bằng một trong các\r\nphương pháp dưới đây:
\r\n\r\n
- Trong tủ sấy ở\r\nnhiệt độ 160 - 1750C không ít hơn 2 giờ.
\r\n\r\n
- Trong nồi hấp áp\r\nlực 1 at (1210C) không ít hơn 20 phút.
\r\n\r\n
3.2.2. Chuẩn bị môi\r\ntrường:
\r\n\r\n
3.2.2.1.Môi trường\r\ndùng để kiểm tra phân vi sinh vật kị khí cố định nitơ, phân giải xenlulo phụ\r\nthuộc vào chủng loại vi sinh vật mà nhà sản xuất sử dụng. Nếu không có yêu cầu\r\ncủa nhà sản xuất, khi kiểm tra sử dụng môi trường ( phụ lục kèm theo).
\r\n\r\n
Môi trường được pha\r\nchế theo thứ tự các hoá chất trong thành phần đã cho. Sau đó phân phối vào các\r\ndụng cụ thuỷ tinh đã chuẩn bị trước rồi khử trùng ở những điều kiện phù hợp. Để\r\nnguội môi trường đến 45-500C rồi phân phối vào các đĩa petri vô\r\ntrùng. Thao tác này được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Kiểm tra độ sạch\r\ncủa môi trường sau 2 ngày ở nhiệt độ từ 28 đến 300C. Chỉ sử dụng các\r\nđĩa petri chứa các môi trường nuôi cấy vi sinh vật không phát hiện thấy tạp\r\nnhiễm.
\r\n\r\n
3.2.2.2. Dịch pha\r\nloãng là nước muối sinh lý (NaCl 0,85%), không chứa các hợp chất nitơ, sau khi\r\nkhử trùng có độ pH là 7,0.
\r\n\r\n
Phân phối dịch pha\r\nloãng vào các ống nghiệm, bình tam giác có dung tích thích hợp với một lượng\r\nsao cho sau khi khử trùng, mỗi ống nghiệm chứa 9ml, mỗi bình tam giác chứa\r\n90ml. Làm nút bông và khử trùng ở 1 at (1210C) trong 30 phút.
\r\n\r\n
Nếu chưa sử dụng\r\nngay, dịch pha loãng cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-100C,\r\nthời gian bảo quản không quá 1 tháng kể từ ngày chuẩn bị.
\r\n\r\n
Ghi chú: Để tránh làm ảnh\r\nhưởng đến các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nên điều chỉnh nhiệt độ\r\ncủa dịch pha loãng đến nhiệt độ phòng thử nghiệm trước khi sử dụng.
\r\n\r\n
3.2.3. Lấy mẫu:
\r\n\r\n
3.2.3.1. Qui định\r\nchung:
\r\n\r\n
Việc lấy mẫu được\r\ntiến hành sao cho mẫu kiểm tra phải là mẫu đại diện cho cả lô hàng. Người lấy\r\nmẫu phải được huấn luyện và có kinh nghiệm trong việc lấy mẫu.
\r\n\r\n
Trong quá trình lấy\r\nmẫu, vận chuyển và xử lý mẫu, phải đảm bảo tránh sự lây nhiễm từ bên ngoài và\r\nphải đảm bảo là mẫu phải được giữ nguyên trạng như ban đầu cho tới khi đem phân\r\ntích trong phòng thí nghiệm.
\r\n\r\n
Không được bổ sung\r\nthêm bất cứ một tác nhân bảo quản, diệt khuẩn hoặc diệt nấm nào vào mẫu kiểm\r\ntra.
\r\n\r\n
Mẫu được lấy phải từ\r\ncác bao nguyên gói.
\r\n\r\n
Phải tiến hành lấy\r\nmẫu ở những nơi không có hơi nước nóng, hoá chất độc hại, không có ánh nắng gay\r\ngắt hoặc bụi và được đưa ngay vào dụng cụ chứa mẫu.
\r\n\r\n
Các dụng cụ lấy mẫu\r\nvà chứa mẫu phải vô trùng.
\r\n\r\n
3.2.3.2. Số lượng\r\nmẫu:
\r\n\r\n
Lô hàng bao gồm các\r\nbao (túi) được sản xuất cùng một đợt với cùng một nguồn nguyên liệu.
\r\n\r\n
Số lượng bao (túi)\r\ncần lấy để kiểm tra đối với mỗi lô hàng phụ thuộc vào độ lớn của lô hàng đó và\r\nphù hợp với qui định trong bảng 1
\r\n\r\n
Bảng 1:\r\nSố lượng bao (túi) cần lấy để kiểm tra
\r\n\r\n
\r\n \r\n | \r\n Cả lô hàng (bao,\r\n túi) \r\n | \r\n \r\n Số lượng mẫu cần\r\n lấy (bao, túi) \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Đến 100 \r\n Từ 101 đến 1000 \r\n Từ 1001 đến 10000 \r\n Lớn hơn 10000 \r\n | \r\n \r\n 7 \r\n 11 \r\n 15 \r\n 19 \r\n | \r\n
\r\n
\r\n\r\n
Các bao (túi) mẫu\r\nđược lựa chọn ngẫu nhiên theo TCVN 1964-75
\r\n\r\n
Tiến hành lấy mẫu\r\ntrung bình từ mẫu cibm là tập hợp các mẫu ban đầu trong lô hàng kiểm tra. Chia\r\nmẫu trung bình làm 2 phần bằng nhau rồi bao gói phù hợp với yêu cầu của sản\r\nphẩm. Một phần dùng để kiểm tra và một phần để lưu và bảo quản trong điều kiện\r\nqui định mà mỗi loại sản phẩm yêu cầu để dùng khi phân tích trọng tài. Trên mỗi\r\ngói mẫu phải có nhãn ghi rõ:
\r\n\r\n
Tên mẫu và đối tượng\r\ncây trồng được sử dụng
\r\n\r\n
Tên cơ sở sản xuất
\r\n\r\n
Thời gian sản xuất
\r\n\r\n
Thời gian và địa điểm\r\nlấy mẫu
\r\n\r\n
Tên người lấy mẫu, cơ\r\nquan lấy mẫu.
\r\n\r\n
3.2.4. Kiểm tra:
\r\n\r\n
3.2.4.1. Mật độ vi\r\nsinh vật kị khí cố định nitơ:
\r\n\r\n
3.2.4.1.1. Pha loãng\r\nmẫu:
\r\n\r\n
a) Đối với mẫu dạng\r\nlỏng: Dùng pipet vô trùng lấy 10ml mẫu cho vào 90ml dịch pha loãng đã chuẩn bị\r\nsẵn (xem 3.2.2.2), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng cách dùng\r\nmột pipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học\r\ntrong 5-10 giây. Dung dịch tạo ra được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu.
\r\n\r\n
b) Đối với mẫu dạng\r\nbột: Cân 10g mẫu có độ chính xác tới 0,01g và cho vào 90ml dịch pha loãng đã\r\nchuẩn bị sẵn (xem 3.2.2.2). Trộn kỹ bằng dụng cụ trộn cơ học từ 5 đến 10 phút\r\nsao cho có được một dung dịch có phân bố đồng đều, để lắng các phần tử nặng\r\ntrong khoảng 15 phút, gạn được dung dịch huyền phù ban đầu.
\r\n\r\n
c) Dùng pipet đã vô\r\ntrùng hút 1ml dịch huyền phù ban đầu (a hoặc b) cho vào 9 ml dịch pha loãng,\r\ntránh chạm pipet vào dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng cách dùng một pipet vô trùng\r\nkhác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học trong 5-10 giây, để có\r\ndịch pha loãng mẫu có nồng độ là 10-2. Lặp lại các thao tác này để\r\nthu được dịch pha loãng đối với phân vi sinh vật trên nền chất mang khử trùng\r\nlà 10-5, 10-6, 10 -7 và đối với phân vi sinh\r\nvật trên nền chất mang không khử trùng là 10-3, 10-4 và\r\n10-5.
\r\n\r\n
3.2.4.1. 2. Cấy mẫu:
\r\n\r\n
Dùng pipet vô trùng\r\nlấy từ dịch mẫu pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 đối\r\nvới phân vi sinh vật trên nền chất mang khử trùng và 10-3, 10-4,\r\n10-5 đối với phân vi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng một\r\nlượng dịch là 0,05 ml (1 giọt) cấy vào 1 đĩa petri chứa môi trường đã chuẩn bị\r\nsẵn (xem 3.2.2.1). Mỗi mẫu pha loãng được cấy lặp lại trên 3 đĩa petri.
\r\n\r\n
Dùng que gạt vô trùng\r\ngạt đều dịch mẫu trên bề mặt thạch, đợi khô và úp ngược hộp petri sau đó đưa\r\nvào nuôi ở điều kiện kị khí (*) trong thời gian và nhiệt độ thích\r\nhợp với từng loại vi sinh vật.
\r\n\r\n
Đếm số lượng khuẩn\r\nlạc đặc trưng của mẫu giống vi sinh vật trên mỗi đĩa petri.
\r\n\r\n
Mật độ vi sinh vật\r\ntrên một đơn vị kiểm tra (ml) được tính theo công thức sau:
\r\n\r\n
Trong đó:
\r\n\r\n
A: Mật độ vi sinh vật\r\ncố định nitơ trên đơn vị kiểm tra (g hoặc ml)
\r\n\r\n
a: số khuẩn lạc trung\r\nbình có trong đĩa petri
\r\n\r\n
d: nồng độ dịch pha\r\nloãng
\r\n\r\n
Ghi chú:
\r\n\r\n
Số lượng khuẩn lạc\r\ntrung bình được tính là trung bình cộng số khuẩn lạc của các đĩa petri được cấy\r\ntừ cùng một độ pha loãng, trong đó chỉ tính các đĩa petri chứa từ 5-50 khuẩn\r\nlạc. Số lượng khuẩn lạc trung bình cũng có thể được tính là trung bình.
\r\n\r\n
Cộng số lượng khuẩn\r\nlạc của các đĩa petri được cấy từ hai độ pha loãng kế tiếp nhau bằng cách tính\r\nsố khuẩn lạc trung bình cộng ở mỗi độ pha loãng, trong đó số khuẩn lạc ở độ pha\r\nloãng cao hơn được nhân với 10, sau đó lấy trung bình cộng của hai giá trị trên\r\nnếu tỷ số giữa giá trị lớn và giá trị nhỏ không lớn hơn 2. Nếu tỷ số này lớn\r\nhơn 2 thì lấy giá trị nhỏ làm kết quả. Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm\r\ntra được biểu thị bằng một số giữa 1,00 và 9,99 nhân với 10n, n là\r\nsố mũ thích hợp.
\r\n\r\n
(*): Có thể sử dụng\r\nmột trong các phương pháp tạo điều kiện kị khí sau:
\r\n\r\n
- Loại bỏ ôxy bằng\r\nphương pháp vật lí:
\r\n\r\n
+ Tủ nuôi kị khí hoặc\r\n
\r\n\r\n
+ Bình hút ẩm có vòi\r\nhút chân không, hàn kín bằng vadơlin, không khí trong bình được hút ra và thay\r\nbằng hỗn hợp khí CO2, N2, H2 (bình chân\r\nkhông). Để loại bỏ ôxy một cách triệt để, trước đó nên đặt vào trong bình các\r\ncốc đựng chất hấp thụ ôxy như dithionit, clorua đồng, iot... Có thể làm giảm\r\ntác dụng của ôxy bằng cách thêm vào môi trường dinh dưỡng các chất khử ôxy như\r\naxit thioglycolic (0,3 ml/l) và systein (0,75 g/l).
\r\n\r\n
- Loại bỏ ôxy trong\r\nkhông khí bằng phương pháp hoá học:
\r\n\r\n
+ Bình nuôi kị khí\r\nGas Pak.
\r\n\r\n
+ Sử dụng dung dịch\r\nxanh metylen-NaOH-glucoza: Trộn đều 3 dung dịch với 1 lượng bằng nhau (6ml NaOH\r\n10N trong 100ml nước cất; 3,0ml xanh metylen 5% trong 100ml nước cất và 6g\r\nglucoza trong 100ml nước cất có bổ sung một chút thymol kết tinh) rồi cho vào\r\nống nghiệm và đun cách thuỷ đến mất màu. Đặt ống chỉ thị này vào thiết bị nuôi\r\ncấy kín. ống chỉ thị sẽ tạo ra tình trạng yếm khí trong thiết bị (ôxy được khử\r\nhoàn toàn khi màu xanh của dung dịch chỉ thị bị biến mất và không tái hiện trở\r\nlại).
\r\n\r\n
- Nuôi cấy trong môi\r\ntrường làm ngập kép: Dịch pha loãng mẫu được trộn với môi trường thạch dinh\r\ndưỡng phù hợp với từng loại vi sinh vật sau khi khử trùng đã để nguội đến 40 -\r\n450C và đổ vào đĩa petri. Sau khi thạch đông đổ thêm một lớp thạch -\r\nnước vô trùng (nguội đến 40 - 450C). ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ\r\nthích hợp.
\r\n\r\n
3.2.4.2. Kiểm tra mật\r\nđộ vi sinh vật kị khí phân giải xenlulo:
\r\n\r\n
3.2.4.2.1. Pha loãng mẫu:
\r\n\r\n
Xem 3.2.4.1.1
\r\n\r\n
3.2.4.2.2. Cấy mẫu:
\r\n\r\n
Xem 3.2.4.1.2
\r\n\r\n
- Phát hiện vòng phân\r\ngiải: Sau khi khuẩn lạc vi sinh vật đã phát triển trên đĩa petri chứa môi\r\ntrường kiểm tra, để đĩa petri vào tủ lạnh trong 12 giờ. Sau đó cho vào tủ ấm 400C\r\ntrong 6 giờ. Lấy ra, cho vào mỗi đĩa petri 5ml thuốc thử lugon, tráng đều khắp\r\nmặt thạch, để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết thuốc thử lugon đi. Đếm số khuẩn lạc\r\ntrong đĩa petri tạo vòng phân giải (vòng trong suốt) bao quanh khuẩn lạc.
\r\n\r\n
- Tính toán kết quả:\r\nxem 3.2.4.1.2.
\r\n\r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
I. Môi trường kiểm\r\ntra vi sinh vật cố định nitơ kị khí:
\r\n\r\n
1. Môi trường 1:
\r\n\r\n
Nước cất 1000ml
\r\n\r\n
Glucoza 20,0g
\r\n\r\n
K2HPO4 1,0g
\r\n\r\n
MgSO4.7H2O \r\n 0,5g
\r\n\r\n
NaCl vết
\r\n\r\n
FeSO4.7H2O vết
\r\n\r\n
MnSO4.5H2O \r\n vết
\r\n\r\n
CaCO3 \r\n 40,0g
\r\n\r\n
axit ascobic 1,0g
\r\n\r\n
E.D.T.A. (Trilon B) 1,0g
\r\n\r\n
Thạch bột \r\n15,0g
\r\n\r\n
2. Môi trường 2:
\r\n\r\n
Nước chiết khoai tây(*) 1000ml
\r\n\r\n
Glucoza 20,0g
\r\n\r\n
K2HPO4 0,2g
\r\n\r\n
MgSO4.7H2O 0,2g
\r\n\r\n
Axit ascobic 1,0g
\r\n\r\n
CaCO3 3,0g
\r\n\r\n
Thạch bột 15,0g
\r\n\r\n
(*) Nước chiết khoai\r\ntây: Khoai tây: 200,0g
\r\n\r\n
Nước cất: 500ml
\r\n\r\n
Khoai tây gọt vỏ, cắt\r\nnhỏ, đun sôi trong 15 phút, lọc trong, bổ sung đủ 1000ml
\r\n\r\n
II. Môi trường kiểm\r\ntra vi sinh vật phân giải xenlulo kị khí:
\r\n\r\n
1. Môi trường 3:
\r\n\r\n
Nước máy 1000ml
\r\n\r\n
NaNH4HPO4 1,5g
\r\n\r\n
KH2PO4 0,5g
\r\n\r\n
NaCl 0,1g
\r\n\r\n
K2HPO4 0,5g
\r\n\r\n
MgSO4.7H2O 0,4g
\r\n\r\n
Pepton 5,0g
\r\n\r\n
CaCO3 2,0g
\r\n\r\n
Dung dịch MnSO4.5H2O\r\n1% 1 giọt
\r\n\r\n
Dung dịch FeSO4.7H2O\r\n1% 1 giọt
\r\n\r\n
CMC \r\n20,0g
\r\n\r\n
Thạch bột \r\n15,0g
\r\n\r\n
pH: 7,0-7,4
\r\n\r\n
2. Môi trường 4:
\r\n\r\n
Nước máy 500ml
\r\n\r\n
Nước thịt-pepton 500ml
\r\n\r\n
CaCO3 2,0g
\r\n\r\n
CMC 15,0g
\r\n\r\n
Thạch bột 15,0g
\r\n\r\n
pH: 7,0-7,4
\r\n\r\n
3. Môi trường 5:
\r\n\r\n
Nước máy 900ml
\r\n\r\n
Nước chiết nấm men 100ml
\r\n\r\n
Glucoza 0,5g
\r\n\r\n
Pepton 5,0g
\r\n\r\n
CMC 3,0g
\r\n\r\n
Thạch bột 15,0g
\r\n\r\n
pH: 7,4
\r\n\r\n
