Cơ quan biên soạn : Bộ môn vi sinh vật
\r\n\r\nCơ quan đề nghị ban hành: Viện khoa học kỹ\r\nthuật
\r\n\r\nnông nghiệp Việt nam
\r\n\r\nCơ quan trình duyệt: Vụ khoa học công nghệ\r\n& CLSP
\r\n\r\nCơ quan ban hành: Bộ Nông nghiệp và PTNT
\r\n\r\nBan hành kèm theo Quyết định số: 54/2000-QĐ/BNN-KHCN\r\n
\r\n\r\nngày 15 tháng 05 năm 2000
\r\n\r\n\r\n\r\n
\r\n(Ban hành kèm theo Quyết định số: 54/2000/QĐ-BNN-KHCN ngày 15 tháng 05 năm\r\n2000)
Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc bảo quản dài\r\nhạn vi sinh vật dị dưỡng hiếu khí và vi hiếu khí sử dụng trong nông nghiệp (trừ\r\nvi sinh vật trong lĩnh vực thú y) dưới dạng là tế bào sinh dưỡng và bào tử\r\ntrong điều kiện vô trùng bằng phương pháp nitơ lỏng.
\r\n\r\n\r\n\r\n2.1. Vi sinh vật nông nghiệp: là các loại vi\r\nsinh vật khác nhau thuộc vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam, nấm men, nấm mốc\r\nđang là đối tượng được nghiên cứu và sử dụng trong nông nghiệp, được Bộ nông\r\nnghiệp và phát triển nông thôn cho phép.
\r\n\r\n2.2. Bảo quản vi sinh vật: là bảo quản các mẫu\r\ngiống thuần khiết sau khi đã chọn lọc, trong điều kiện phù hợp để bảo đảm độ\r\nsống sót cao và bảo tồn các tính trạng ban đầu.
\r\n\r\n2.3. Bảo quản dài hạn: là bảo quản các mẫu\r\ngiống trong thời gian trên 2 năm.
\r\n\r\n2.4. Đặc tính sinh học: là khả năng của vi sinh\r\nvật thông qua hoạt động sống của chúng có tác dụng đến quá trình sinh trưởng,\r\nphát triển của cây trồng,vật nuôi, kiểm soát sinh học và sinh thái môi trường.
\r\n\r\n2.5. Môi trường nuôi cấy chọn lọc: là môi\r\ntrường chỉ phù hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của một loài hay một nhóm vi\r\nsinh vật nào đó.
\r\n\r\n2.6. Môi trường chẩn đoán phân biệt (môi trường\r\nchỉ thị): là môi trường cho phép phân biệt nhanh chóng một loại vi sinh vật này\r\nvới các loại vi sinh vật khác.
\r\n\r\n2.7. Mẫu giống: là giống do tác giả thu thập,\r\nchọn lọc, lai tạo hay lấy từ quĩ gen có tính di truyền ổn định.
\r\n\r\n2.8. Thời gian cấy chuyển: là khoảng thời gian\r\ngiữa 2 lần cấy để duy trì các tính trạng của vi sinh vật.
\r\n\r\n2.9. Độ phần trăm sống sót của mẫu giống: là tỷ\r\nlệ phần trăm của số lượng tế bào sống sót trong các mẫu giống bảo quản so với\r\nmẫu giống gốc khi mới được nuôi cấy và phát triển ổn định.
\r\n\r\n2.10. Hồi phục giống: là quá trình cấy chuyển\r\nvi sinh vật từ mẫu bảo quản vào môi trường dinh dưỡng thích hợp để vi sinh vật\r\nkhôi phục lại các tính trạng ban đầu.
\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n- Tủ sấy (thiết bị tiệt trùng khô) và nồi hấp\r\náp lực (thiết bị tiệt trùng ướt)
\r\n\r\n- Tủ ấm
\r\n\r\n- Tủ cấy vô trùng
\r\n\r\n- Tủ lạnh sâu
\r\n\r\n- Bình để mẫu vi sinh vật có chứa nitơ lỏng
\r\n\r\n- Bình trữ nitơ lỏng
\r\n\r\n- Găng tay (Poleyolefin)
\r\n\r\n- Ống nghiệm polypropylen có nút xoáy, dung\r\ntích 2ml, chịu nhiệt độ thấp, khử trùng được hoặc ampul thuỷ tinh trung tính
\r\n\r\n- Cân kỹ thuật có độ chính xác tới 0,01g
\r\n\r\n- Que cấy
\r\n\r\n- Que gạt thủy tinh
\r\n\r\n- Ống nghiệm thủy tinh
\r\n\r\n- Ống đong
\r\n\r\n- Bình tam giác
\r\n\r\n- Đĩa petri (hộp lồng)
\r\n\r\n- Pipet chia độ, pipetman
\r\n\r\n- Đèn cồn hoặc đèn gas
\r\n\r\n\r\n\r\n3.2.1. Chuẩn bị dụng cụ:
\r\n\r\n- Các dụng cụ dùng trong xác định vi\r\nsinh vật phải tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây:
\r\n\r\n+ Trong tủ sấy ở nhiệt độ 160 - 1750C\r\nkhông ít hơn 2 giờ.
\r\n\r\n+ Trong nồi hấp áp lực 1atmotphe (1210C)\r\nkhông ít hơn 20 phút.
\r\n\r\n- Chuẩn bị ống nghiệm polypropylen (hoặc\r\nampul): ngâm trong dung dịch HCl 2% trong 12 giờ. Sau đó rửa lại bằng nước máy\r\n3 - 4 lần và tráng lại bằng nước cất rồi khử trùng trong nồi hấp áp lực\r\n1atmotphe (1210C) không ít hơn 20 phút.
\r\n\r\n3.2.2. Chuẩn bị môi trường:
\r\n\r\n- Môi trường nuôi cấy sinh khối và kiểm\r\ntra độ phần trăm sống sót của mẫu giống là môi trường nuôi cấy chọn lọc (mục\r\n2.5).
\r\n\r\nCân và hoà tan các thành phần môi trường\r\ntrong nước cất theo thứ tự đã cho. Phân phối môi trường vào các bình tam giác.\r\nĐậy nút bông, khử trùng ở điều kiện phù hợp cho từng loại môi trường.
\r\n\r\n- Môi trường bảo vệ: có tỷ lệ sữa tách\r\nbơ 10% (w/v), hoặc glyxerol 10% (v/v), hoặc Dimetyl sunfoxide (DMSO) 5% (v/v).\r\nMôi trường bảo vệ cần được tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur, hoặc màng lọc\r\nvi khuẩn hoặc ở 1210C trong 15 phút.
\r\n\r\n3.2.3. Chuẩn bị mẫu giống:
\r\n\r\n- Một mẫu giống vật liệu cần giữ một\r\nlượng mẫu lặp lại không ít hơn ba lần.
\r\n\r\n- Không được chọn những khuẩn lạc riêng\r\nbiệt trong các lần cấy chuyển làm giống (tránh đột biến sinh trưởng).
\r\n\r\n- Việc lấy mẫu được tiến hành sao cho\r\nmẫu kiểm tra phải là mẫu thuần. Người lấy mẫu phải được huấn luyện và có kinh\r\nnghiệm trong việc lấy mẫu.
\r\n\r\n- Trong quá trình lấy mẫu, vận chuyển và\r\nxử lý mẫu phải đảm bảo tránh sự tạp nhiễm từ bên ngoài và đảm bảo được tính\r\nnguyên trạng ban đầu.
\r\n\r\n3.2.4. Chuẩn bị dịch huyền phù: theo 2\r\ncách
\r\n\r\n3.2.4.1. Chuẩn bị dịch huyền phù từ mẫu\r\ngiống nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng:
\r\n\r\nCác mẫu giống được nuôi cấy trên môi\r\ntrường thạch nghiêng thích hợp. Sau khi tế bào phát triển tốt, ổn định (pha\r\nsinh trưởng), thu sinh khối vi sinh vật để tiến hành bảo quản.
\r\n\r\nDùng pipet vô trùng hút 5ml môi trường\r\ndinh dưỡng (NB) chứa 10% (v/v) glycerol hoặc 5% (v/v) DMSO hoặc 10% (w/v) sữa\r\ntách bơ vào mỗi ống thạch nghiêng.
\r\n\r\nDùng pipet vô trùng hút 5ml môi trường\r\ndinh dưỡng (NB) chứa 10% (v/v) glycerol hoặc 5% (v/v) DMSO hoặc 10% (w/v) sữa\r\ntách bơ vào mỗi ống thạch nghiêng.
\r\n\r\nDùng dụng cụ vô trùng đánh tan toàn bộ\r\nsinh khối trên bề mặt thạch nghiêng vào môi trường, sau đó hút toàn bộ dịch\r\nhuyền phù tế bào, đảm bảo mật độ tế bào ít nhất là 108 tế bào/ml.
\r\n\r\nDùng pipet vô trùng phân 1ml của dịch\r\nhuyền phù tế bào vào ống nghiệm polypropylen, vặn chặt nút . Có thể sử dụng\r\nampul thuỷ tinh, gắn đầu ampul bằng đèn khò. Không để rây dịch vi sinh lên mép\r\nhoặc thành ống nghiệm polypropylen hoặc ampul.
\r\n\r\nĐặt ampul trong tủ lạnh 50C\r\ntrong 30 phút để đạt được sự ổn định giữa tế bào và môi trường.
\r\n\r\n3.2.4.2. Chuẩn bị dịch huyền phù từ mẫu\r\ngiống nuôi cấy trên môi trường dịch thể:
\r\n\r\nCác mẫu giống được nuôi cấy trên môi\r\ntrường dịch thể thích hợp. Sau khi tế bào phát triển tốt, ổn định, tiến hành\r\nbảo quản bằng nitơ lỏng.
\r\n\r\nDùng pipet vô trùng bổ sung một lượng\r\n20% (v/v) glycerol hoặc 10% (v/v) DMSO hoặc 20% sữa tách bơ đã khử trùng bằng\r\nthể tích của dịch vi sinh vật để đạt nồng độ glycerol cuối cùng 10% (v/v) hoặc\r\nDMSO 5% (v/v) hoặc sữa tách bơ 10% (w/v).
\r\n\r\nLắc nhẹ để thu được dịch huyền phù tế\r\nbào đồng đều, đảm bảo mật độ tế bào ít nhất là 108 tế bào/ml. Nếu\r\ngiống vi sinh vật mọc thành viên nhỏ hay thành đám lớn, có thể dùng máy nghiền\r\nmô nhỏ hoặc cối sứ vô trùng để nghiền nát.
\r\n\r\nDùng pipet vô trùng phân 1ml của dịch\r\nhuyền phù tế bào vào ống nghiệm polypropylen, vặn chặt nút . Có thể sử dụng\r\nampul thuỷ tinh, gắn đầu ampul bằng đèn khò. Không để rây dịch vi sinh lên mép\r\nhoặc thành ống nghiệm polypropylen hoặc ampul.
\r\n\r\nĐặt ampul trong tủ lạnh 50C\r\ntrong 30 phút để đạt được sự ổn định giữa tế bào và môi trường.
\r\n\r\n3.2.5. Quá trình bảo quản bằng nitơ\r\nlỏng: được tiến hành như sau:
\r\n\r\nĐặt ống nghiệm polypropylen (ampul) vào\r\ntrong khay nhôm. Sau đó đặt vào buồng làm lạnh của máy làm lạnh.
\r\n\r\nĐiều chỉnh tốc độ làm lạnh 1-20C/phút\r\nđến khi nhiệt độ đạt âm 300C. Sau đó tiếp tục điều chỉnh tốc độ làm\r\nlạnh 10C/phút đến khi nhiệt độ đạt không nhỏ hơn âm 500
\r\n\r\nNhanh chóng chuyển ống nghiệm\r\npolypropylen (ampul) đến vị trí bảo quản cuối cùng trong bình nitơ lỏng (nhiệt\r\nđộ từ âm1560C đến âm 1960C).
\r\n\r\nGhi chú: Cần đi\r\ngăng tay poleyolefin khi thao tác để tránh bị bỏng tay.
\r\n\r\n\r\n\r\nĐịnh kỳ hàng năm kiểm tra độ sống sót và\r\nđặc tính sinh học của giống. Chỉ cho phép giữ lại các giống có độ sống\r\nsót và có hoạt tính sinh học ổn định như giống gốc.
\r\n\r\n3.3.1. Kiểm tra độ sống sót của giống:
\r\n\r\n3.3.1.1. Môi trường để kiểm tra:
\r\n\r\nDùng môi trường nuôi cấy chọn lọc là môi\r\ntrường để kiểm tra. Môi trường được pha chế theo thứ tự các hoá chất trong\r\nthành phần đã cho. Sau đó phân phối vào các dụng cụ thuỷ tinh đã chuẩn bị trước\r\nrồi khử trùng ở những điều kiện phù hợp. Để nguội môi trường đến 45-500C\r\nrồi phân phối vào các đĩa petri vô trùng. Thao tác này được thực hiện trong\r\nđiều kiện vô trùng.
\r\n\r\n3.3.1.2. Dịch pha loãng: Nước muối sinh\r\nlý (NaCl 0,85%), không chứa các hợp chất nitơ, sau khi khử trùng có độ pH là\r\n7,0.
\r\n\r\nPhân phối dịch pha loãng vào các ống\r\nnghiệm có dung tích thích hợp với một lượng sao cho sau khi khử trùng, mỗi ống\r\nnghiệm chứa 9ml. Làm nút bông và khử trùng ở 1 atmotphe (1210C)\r\ntrong 30 phút.
\r\n\r\nNếu chưa sử dụng ngay, dịch pha loãng\r\ncần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-100C, thời gian bảo\r\nquản không quá 1 tháng kể từ ngày chuẩn bị.
\r\n\r\nGhi chú: Để tránh làm\r\nảnh hưởng đến các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nên điều chỉnh\r\nnhiệt độ của dịch pha loãng đến nhiệt độ phòng thử nghiệm trước khi sử dụng.
\r\n\r\n3.3.1.3. Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào\r\n(suspension):
\r\n\r\nLấy ống giống bảo quản cần kiểm tra ra\r\nkhỏi bình nitơ lỏng, cho băng tan tự nhiên (trong điều kiện phòng thử nghiệm).
\r\n\r\nLau bên ngoài của ống nghiệm\r\npolypropylen (ampul) bằng gạc vô trùng có thấm etanol 70% (v/v), đặc biệt chú ý\r\nđến vùng giữa nút và thân ống.
\r\n\r\nMở nút ống nghiệm polypropylen (ampul)\r\ntrong điều kiện vô trùng. Dùng bơm tiêm đã vô trùng hút 1ml dịch huyền phù\r\ntrong ống nghiệm cho vào 9 ml dịch pha loãng, tránh chạm bơm tiêm vào dịch pha\r\nloãng. Trộn kỹ bằng cách dùng một pipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc\r\nbằng dụng cụ trộn cơ học trong 5-10 giây. Lặp lại các thao tác này để thu được\r\ndịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6,\r\n10-7.
\r\n\r\nCấy mẫu: dùng pipet vô trùng lấy từ dịch\r\nmẫu pha loãng một lượng 0,05 ml mẫu (1 giọt) cấy vào 1 đĩa petri chứa môi\r\ntrường đã chuẩn bị sẵn (xem 3.3.1). Mỗi mẫu pha loãng được cấy vào 3 đĩa petri\r\n(mỗi độ pha loãng sử dụng 1 pipet vô trùng riêng).
\r\n\r\nDùng que gạt vô trùng gạt đều dịch mẫu\r\ntrên bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch, úp ngược đĩa petri, để trong tủ ấm với\r\nnhiệt độ và thời gian thích hợp.
\r\n\r\nĐếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của mẫu\r\ngiống vi sinh vật trên mỗi đĩa petri.
\r\n\r\nMật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm\r\ntra (ml) được tính theo công thức sau:
\r\n\r\n| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Trong đó:
\r\n\r\nA: số khuẩn lạc/ml dịch
\r\n\r\na: số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa petri
\r\n\r\nd: nồng độ dịch pha loãng
\r\n\r\n20: số giọt dịch trong 1 ml dịch
\r\n\r\nGhi chú: Số lượng khuẩn lạc trung bình được\r\ntính là trung bình cộng số khuẩn lạc của các đĩa petri được câý từ cùng một độ\r\npha loãng, trong đó chỉ tính các đĩa petri chứa từ 30-300 khuẩn lạc. Số lượng\r\nkhuẩn lạc trung bình cũng có thể được tính là trung bình cộng số lượng khuẩn\r\nlạc của các đĩa petri được cấy từ hai độ pha loãng kế tiếp nhau bằng cách tính\r\nsố khuẩn lạc trung bình cộng ở mỗi độ pha loãng, trong đó số khuẩn lạc ở độ pha\r\nloãng cao hơn được nhân với 10, sau đó lấy trung bình cộng của hai giá trị trên\r\nnếu tỷ số giữa giá trị lớn và giá trị nhỏ không lớn hơn 2. Nếu tỷ số này lớn\r\nhơn 2 thì lấy giá trị nhỏ làm kết quả. Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm\r\ntra được biểu thị bằng một số giữa 1,00 và 9,99 nhân với 10n, n là\r\nsố mũ thích hợp.
\r\n\r\n| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
3.3.2. Xác định đặc tính sinh học:
\r\n\r\nTiến hành theo những phương pháp cụ thể phụ\r\nthuộc vào đặc tính sinh học của từng chủng vi sinh vật.
\r\n\r\n\r\n\r\n
Từ khóa: Tiêu chuẩn ngành 10TCN416:2000, Tiêu chuẩn ngành số 10TCN416:2000, Tiêu chuẩn ngành 10TCN416:2000 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Tiêu chuẩn ngành số 10TCN416:2000 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Tiêu chuẩn ngành 10TCN416:2000 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 10TCN416:2000
File gốc của Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 416:2000 về phương pháp bảo quản dài hạn nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp bằng nitơ lỏng do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 416:2000 về phương pháp bảo quản dài hạn nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp bằng nitơ lỏng do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn |
| Số hiệu | 10TCN416:2000 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn ngành |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2000-05-15 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng |