TIÊU\r\nCHUẨN QUỐC GIA

TCVN\r\n13262-3:2020

THUỐC\r\nBẢO VỆ THỰC VẬT – PHẦN 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT NHÓM AUXINS BẰNG PHƯƠNG\r\nPHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Pesticides -\r\nPart 3: Determination of auxins group content by high performance liquid\r\nchromatographic method

Lời nói đầu

13262-3: 2020 do Cục Bảo vệ thực vật biên\r\nsoạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo\r\nlường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THUỐC BẢO VỆ\r\nTHỰC VẬT – PHẦN 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT NHÓM AUXINS BẰNG PHƯƠNG PHÁP\r\nSẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Pesticides -\r\nPart 3: Determination of auxins group content by high performance liquid\r\nchromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định\r\ntổng hàm lượng hoạt chất nhóm auxins thực vật gồm ((indole-3-acetic acid (IAA),\r\nindole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA), indole-3-\r\ncarboxylic acid (ICA)) trong thuốc bảo vệ thực vật bằng phương pháp sắc ký lỏng\r\nhiệu năng cao. Thông tin giới thiệu hoạt chất nhóm auxins xem Phụ lục A.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết\r\ncho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân\r\ntích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

3  Nguyên tắc

Tổng auxins thực vật gồm (indole-3-acetic\r\nacid (IAA), indole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA),\r\nindole-3-carboxylic acid (ICA)) được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu\r\nnăng cao, sử dụng cột pha đảo (C18) với detector tử ngoại (DAD, MWD, PDA,...\r\nhoặc tương đương), ở bước sóng 280 nm. Kết quả định danh được xác định dựa trên\r\nsự so sánh giữa thời gian lưu của píc mẫu thử và píc chuẩn. Kết quả định lượng\r\nđược xác định dựa trên đường chuẩn.

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân\r\ntích, nước dùng trong quá trình phân tích đạt loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696)\r\nhoặc có độ tinh khiết tương đương.

4.1  Chất chuẩn\r\nindole-3-acetic acid (IAA), đã biết hàm lượng, có giấy chứng nhận.

4.2  Chất chuẩn\r\nindole-3-butyric acid (IBA), đã biết hàm lượng, có giấy chứng nhận.

4.3  Chất chuẩn\r\nindole-3-propionic acid (IPA), đã biết hàm lượng, có giấy chứng nhận.

4.4  Chất chuẩn\r\nindole-3-carboxylic acid (ICA), đã biết hàm lượng, có giấy chứng nhận.

4.5  Axetonitril (C₂H₃N),\r\ndùng cho sắc ký lỏng.

4.6  Metanol (CH₄O),\r\ndùng cho sắc ký lỏng.

4.7  Axit axetic băng (C₂H₄O₂),\r\ndùng cho sắc ký lỏng.

4.8  Dung dịch axit axetic, nồng độ\r\nkhoảng 0,8 % theo thể tích

Dùng pipet (5.3) lấy 8 ml axit axetic băng\r\n(4.7) cho vào cốc dung tích 1000 ml (5.1) có chứa sẵn 1000 ml nước cất. Siêu âm\r\n10 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

4.9  Dung dịch chuẩn gốc

4.9.1  Dung dịch chuẩn gốc IAA, nồng độ\r\nkhoảng 1000 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g\r\nchất chuẩn IAA (4.1), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 10 ml (5.2),\r\nhòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội\r\nđến nhiệt độ phòng.

4.9.2  Dung dịch chuẩn gốc IBA, nồng độ\r\nkhoảng 1000 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g\r\nchất chuẩn IBA (4.2), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 10 ml (5.2),\r\nhòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội\r\nđến nhiệt độ phòng.

4.9.3  Dung dịch chuẩn gốc IPA, nồng độ\r\nkhoảng 1000 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g\r\nchất chuẩn IPA (4.3), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 10 ml (5.2),\r\nhòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội\r\nđến nhiệt độ phòng.

4.9.4  Dung dịch chuẩn gốc ICA, nồng độ\r\nkhoảng 500 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g\r\nchất chuẩn ICA (4.4), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 20 ml (5.2),\r\nhòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội\r\nđến nhiệt độ phòng.

4.10  Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung\r\ngian

Nồng độ IAA, IBA, IPA khoảng 100 mg/l, nồng\r\nđộ ICA khoảng 50 mg/l

Dùng pipet chia vạch (5.3) hút 2 ml các dung\r\ndịch chuẩn gốc IAA (4.9.1), IBA (4.9.2), IPA (4.9.3), ICA (4.9.4) vào bình định\r\nmức 20 ml (5.2), định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 1 min, để\r\nnguội đến nhiệt độ phòng.

4.11  Dãy dung dịch chuẩn làm việc

Dãy dung dịch chuẩn làm việc IAA, IBA, IPA\r\nnồng độ khoảng 5; 10; 20; 50; 80 mg/l

Dãy dung dịch chuẩn làm việc ICA, nồng độ\r\nkhoảng 2,5; 5; 10; 25; 40 mg/l

Dùng pipet chia vạch (5.3) lấy chính xác 0,5;\r\n1; 2; 5; 8 ml dung dịch chuẩn trung gian IAA, IBA, IPA, ICA (4.10) vào lần lượt\r\n5 bình định mức 10 ml (5.2), định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm\r\ntrong 1 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

CHÚ THÍCH 1:

1) Chất chuẩn bảo quản trong tủ mát ở 4 °C ±\r\n2 °C;

2) Nếu sử dụng cân có cấp chính xác 0,0001 g\r\nthì lượng mẫu và chuẩn tăng lên 10 lần;

3) Dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn\r\ntrung gian nên bảo quản ở 4 °C ± 2 °C, nên sử dụng trong vòng 1 tháng kể từ\r\nngày pha;

4) Dung dịch chuẩn phải kiểm tra chất lượng\r\ntrước khi sử dụng.

5) Dung dịch chuẩn làm việc nên sử dụng ngay\r\nsau khi pha từ dung dịch chuẩn trung gian.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường\r\ncủa phòng thử nghiệm cụ thể như sau:

5.1  Cốc thủy tinh, dung tích\r\n100 ml; 1000 ml.

5.2  Bình định mức, dung tích\r\n10 ml; 20 ml; 50 ml.

5.3  Pipet chia vạch, dung tích\r\n0,5 ml; 1 ml; 2 ml; 5 ml; 10 ml.

5.4  Xyranh bơm mẫu, dung tích 50\r\nμl, chia vạch đến 1 μl. hoặc bơm mẫu tự động

5.5  Màng lọc xyranh PTFE, có kích\r\nthước lỗ 0,45 μm, đường kính 25 mm.

5.6  Bể siêu âm, tần số siêu\r\nâm từ 40 kHz đến 100 kHz

5.7  Cân phân tích, có độ chính\r\nxác đến 0,00001 g và 0,0001 g.

5.8  Sàng rây, đường kính lỗ\r\n0,2 mm.

5.9  Xyranh lọc mẫu, dung tích 1\r\nml dùng cho màng lọc (5.5)

5.10  Thiết bị lọc

Dùng được cho màng lọc dung môi đường kính 13\r\nmm, kích thước lỗ 0,45 μm để lọc dung môi pha động của HPLC

CHÚ THÍCH 2: Lọc dung môi pha động qua màng\r\nlọc trước khi dùng để kéo dài thời gian sử dụng của cột.

5.11  Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng\r\ncao,\r\nđược trang bị như sau:

- Detector tử ngoại (DAD, MWD, PDA,... hoặc\r\ntương đương);

- Hệ thống bơm cao áp;

- Buồng điều nhiệt cột tách;

- Máy tích phân hoặc máy vi tính;

- Cột RP C18, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm,\r\ncỡ hạt pha tĩnh 5 μm hoặc loại tương đương;

- Bộ bơm mẫu tự động hoặc bơm mẫu bằng tay.

6  Lấy mẫu và chuẩn\r\nbị mẫu

6.1  Lấy mẫu

Tiêu chuẩn này không qui định việc lấy mẫu.

Nên lấy mẫu theo TCVN 12017 : 2017

6.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu cần được làm đồng nhất trước khi cân: Đối\r\nvới mẫu dạng lỏng phải lắc đều, nếu bị đông đặc do nhiệt độ thấp cần được làm\r\ntan chảy ở nhiệt độ (30 ± 2) °C; đối với mẫu dạng bột phải được trộn đều; đối\r\nvới mẫu dạng hạt thì phải nghiền mịn và rây qua rây có đường kính lỗ 0,2 mm\r\n(5.8), trộn đều làm mẫu phân tích.

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Dùng cân phân tích (5.7) cân 2 phần mẫu thử\r\nmỗi phần khoảng 2 g, chính xác đến 0,0001 g vào cốc dung tích 100 ml (5.1),\r\nthêm 10 ml metanol (4.6). Đặt vào bể siêu âm (5.6), siêu âm 30 min, để nguội\r\nđến nhiệt độ phòng, chuyển toàn bộ vào bình định mức 20 ml (5.2), tráng rửa 2\r\nlần mỗi lần 3 ml metanol (4.6). Định mức đến vạch bằng metanol (4.6), lọc qua\r\nmàng lọc xyranh 0,45 μm (5.5) trước khi bơm vào thiết bị.

7.2  Điều kiện phân tích

Các điều kiện vận hành sắc ký sau đây được\r\ncho là thích hợp:

Pha động: Axetonitril (4.5): dung dịch axit\r\naxetic (4.8) =20 : 80 (theo thể tích)

Cột phân tích: Cột RP C18, dài 250 mm, đường\r\nkính 4,6 mm, cỡ hạt pha tĩnh 5 μm hoặc loại tương đương

Bước sóng: 280 nm

Tốc độ dòng: 1 ml/min

Thể tích bơm mẫu: 10 μl

Nhiệt độ buồng cột: 25 °C

7.3  Dựng đường chuẩn

Dựng đường chuẩn (tương quan giữa diện tích\r\npíc và nồng độ chất chuẩn) của mỗi hoạt chất tại 5 điểm có nồng độ tương ứng\r\ndung dịch chuẩn làm việc (4.11).

7.4  Xác định

Dùng xyranh (5.4) bơm điểm nồng độ thấp nhất\r\ntrong dãy dung dịch chuẩn làm việc (4.11) cho đến khi số đo diện tích của pic\r\nchuẩn thay đổi không lớn hơn 3 %. Sau đó, bơm lần lượt dung dịch chuẩn làm việc\r\ntừ nồng độ thấp đến cao (4.11) và dung dịch mẫu thử (7.1), lặp lại 2 lần ( số\r\nđo diện tích của pic chuẩn thay đổi không lớn hơn 3 % so với giá trị ban đầu).\r\nNếu nồng độ của mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn thì điều chỉnh bằng cách pha\r\nloãng dung dịch mẫu thử bằng metanol (4.6).

8  Tính kết quả

Hàm lượng hoạt chất auxins trong mẫu là tổng\r\nhàm lượng các loại auxins được quy định trong mục 1, X, biểu thị bằng\r\nmiligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức:

trong đó:

X_0i là nồng độ\r\ncủa auxins thứ i trong mẫu tính theo đường chuẩn, tính bằng miligam trên lít\r\n(mg/l);

V là thể tích dung môi\r\nchiết mẫu mililit (ml)

m là khối lượng mẫu\r\nthử, tính bằng gam (g)

P_i là độ tinh khiết của\r\nchất chuẩn auxins thứ i

Kết quả thử nghiệm thu được, lấy hai chữ số\r\nsau dấu phẩy.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết\r\nđầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn\r\ntiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong\r\ntiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có\r\nảnh hưởng tới kết quả;

Phụ\r\nlục A

(Tham\r\nkhảo)

Thông tin về hoạt chất auxins

A.1  Giới thiệu hoạt chất\r\nindole-3-acetic acid

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất: indole-3-acetic acid

- Tên hóa học: IUPAC: 2-(1H-indol-3-yl)\r\naxetic acid

- Công thức phân tử: C₁₀H₉NO₂

- Khối lượng phân tử: 75,19

- Nhiệt độ nóng chảy: 162 °C đến 165 °C

- Độ hòa tan: Không tan trong nước, tan trong\r\nethanol: 50 mg/ml

- Dạng bên ngoài: Chất rắn, màu trắng

A.2  Giới thiệu hoạt chất\r\nindole-3-butyric acid

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất: indole-3-butyric acid

- Tên hóa học: IUPAC: 4- (1H-indol-3-yl)\r\nbutanoic acid

- Công thức phân tử: C₁₂H₁₃NO₂\r\n

- Khối lượng phân tử: 203,24

- Nhiệt độ nóng chảy: 125 °C

- Dạng bên ngoài: Tinh thể, màu trắng đến\r\nvàng.

A.3  Giới thiệu hoạt chất\r\nindole-3-propionic acid

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất: indole-3-propionic acid

- Tên hóa học: IUPAC: 3-(1H-indole-3-yl) propanoic\r\nacid

- Công thức phân tử: C₁₁H₁₁NO₂

- Khối lượng phân tử: 189,21

- Nhiệt độ nóng chảy: 134 °C đến 135 °C

- Dạng bên ngoài: Tinh thể màu trắng.

A.4  Giới thiệu hoạt chất\r\nindole-3-carboxylic acid

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất: indole-3-carboxylic acid

- Tên hóa học: IUPAC: 1H-indole-3-carboxylic\r\nacid

- Công thức phân tử: C₉H₇NO₂

- Khối lượng phân tử: 161,16

- Nhiệt độ nóng chảy: 205 °C đến 209 °C

- Dạng bên ngoài: Tinh thể màu trắng.

A.5  Hiệu suất thu hồi và giới hạn\r\nđịnh lượng

- Hiệu suất thu hồi của phương pháp: từ 80 % đến\r\n110 %

- Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ):

- IAA: 50 mg/kg

- IBA: 20 mg/kg

- IPA: 50 mg/kg

- ICA: 50 mg/kg

- Độ lặp lại của phương pháp, CV ≤ 7 %.

Phụ\r\nlục B

(Tham\r\nkhảo)

Thông tin về sắc ký đồ điển hình của nhóm\r\nauxins

Thư mục tài\r\nliệu tham khảo

[1] TCVN 12017: 2017 Thuốc bảo vệ thực\r\nvật- Lấy mẫu

[2] Danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép\r\nsử dụng ở Việt Nam

[3] Manual pesticides

[4] Determination of plant hormones in\r\nfertilizers by high-performance liquid chromatography with photodiode array\r\ndetection: Method development and single-laboratory validation

[5] .“Current analytical methods for plant\r\nauxin quantification- a review”, analytica Chimica Acta, journal homepage: www.elsevier.com/locate/aca

[6] .“HPLC-based in quantification of\r\nindole-3-axetic acid in the primary root tip of maize”, JNBT, Vol.3 No1,\r\np.40-45.