TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-20:2019

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 20: BỆNH HOẠI TỬ DƯỚI VỎ VÀ CƠ QUAN TẠO MÁU Ở TÔM

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 20: Infection with infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus disease in shrimp

Lời nói đầu

TCVN 8710-20:2019 thay thế TCVN 8379:2010

TCVN 8710-20:2019 do Chi cục Thú y Vùng VI - Cục Thú y biên soạn trên cơ sở tham khảo tài liệu của Tổ chức Thú y Thế Giới (OIE) và các bài báo khoa học quốc tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán gồm các phần:

- TCVN 8710-01: 2011, phần 1: Bệnh Còi do vi rút ở tôm (MBV);

- TCVN 8710-02: 2011, phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển (VNN);

- TCVN 8710-03: 2011, phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm (WSSV);

- TCVN 8710-04: 2011, phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm (YHV);

- TCVN 8710-05: 2011, phần 5: Bệnh Taura ở tôm He (TSV);

- TCVN 8710-06: 2019, phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép (KHV);

- TCVN 8710-07: 2012, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (SVC);

- TCVN 8710-08: 2012, phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

- TCVN 8710-09: 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm (NHB);

- TCVN 8710-10: 2015, phần 10: Bệnh do perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-11: 2015, phần 11: Bệnh do perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-12: 2015, phần 12: Bệnh do vi bào tử ở tôm;

- TCVN 8710-13: 2015, phần 13: Bệnh do vi rút HPV ở tôm;

- TCVN 8710-14: 2015, phần 14: Bệnh EUS ở cá;

- TCVN 8710-15: 2015, phần 15: Bệnh do Aeromonas ở cá;

- TCVN 8710-16: 2016, phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

- TCVN 8710-17: 2016, phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

- TCVA/ 8710-19: 2019, phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

- TCVN 8710-20: 2019, phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

- TCVN 8710-21: 2019, phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá.

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 20: BỆNH HOẠI TỬ DƯỚI VỎ VÀ CƠ QUAN TẠO MÁU Ở TÔM

Aquatic Animal disease - Diagnostic procedure - Part 20: Infection with infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus disease in shrimp

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm. Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng cho các loài giáp xác khác.

2  Thuật ngữ và định nghĩa, các từ viết tắt

2.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút IHHN gây ra.

Vi rút IHHN (Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus - IHHNV) có tên là Parvovirus, họ Parvoviridae, cấu trúc di truyền là phân tử ADN mạch đơn (ssADN), kích thước bộ gen khoảng 3,9 kb (GenBank AF218266).

CHÚ THÍCH: Vi rút IHHN có ít nhất 4 typ bao gồm: typ 1 (có nguồn gốc từ Châu Mỹ và Đông Á, chủ yếu là Philippines); typ 2 (từ Đông Nam Á); typ 3A (từ Đông Phi, Ấn Độ và Úc) và typ 3B (từ vùng Tây Ấn Độ Dương - Thái Bình Dương như: Madagascar, Mauritius và Tanzania). Vi rút thuộc typ 1 và 2 thường gây bệnh trên tôm thẻ xanh (Penaeus stylirostris), tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và tôm sú (Penaeus monodon). Trong khi đó, vi rút typ 3A và 3B không gây bệnh trên những loài tôm này nhưng một số trình tự gen di truyền của chúng lại chèn vào đoạn gen di truyền của vật chủ (P. monodon).

2.2  Từ viết tắt

- ADN (Deoxyribonucleic acid): Axít deoxyribonucleic;

- ssADN (single-straind AND): ADN sợi đơn;

- DNAse (Deoxyribonuclease): enzyme thủy phân liên kết của phân tử ADN;

- RNA (Ribonucleic acid): Axít ribonucleic;

- RNAse (Ribonuclease): enzyme thủy phân liên kết của phân tử ARN

- IHHNV (Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus): Vi rút gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

- PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp;

- Realtime PCR: Phản ứng realtime PCR;

- PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phốt phát;

- TBE 10X (Tris-axit boric- Ethylendiamin Tetraacetic axit): Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần;

- Ct (cycle threshold): giá trị chu kỳ ngưỡng.

3  Thuốc thử, vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAse và DNAse, trừ khi có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho lấy mẫu

3.1.1  Cồn (Ethanol), từ 70 % đến 100 % (C₂H₆O);

3.1.2  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) (xem Phụ lục A);

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR, realtime PCR

3.2.1  Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;

3.2.2  Kít nhân gen PCR, realtime PCR;

3.2.3  Nước tinh khiết, không có DNAse/RNAse.

3.2.4  Bột agarose, dung dịch TBE 10X;

3.2.5  Chất nhuộm gel (GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

3.2.6  Dung dịch nạp mẫu (Loading dye);

3.2.7  Thang chuẩn ADN;

3.2.8  Đoạn mồi (primers): thực hiện phản ứng PCR;

3.2.9  Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe): thực hiện phản ứng realtime PCR;

3.2.10  Mẫu đối chứng: Mẫu đối chứng dương là mẫu có chứa ADN của vi rút IHHN được chiết tách từ mẫu dương chuẩn. Mẫu đối chứng âm là mẫu nước không có DNAse/ RNAse dùng để pha loãng các chất phản ứng.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1  Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0 °C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

4.1.2  Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

4.1.3  Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

4.1.4  Máy nghiền mẫu hoặc cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, vô trùng;

4.1.5  Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

4.2  Thiết bị, dụng cụ cho phương pháp PCR, realtime PCR

4.2.1  Máy nhân gen (PCR, realtime PCR);

4.2.2  Máy ly tâm lạnh, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

4.2.3  Máy lắc ủ nhiệt;

4.2.4  Máy spindown, ly tâm lắng;

4.2.5  Máy chiết tách ADN/ARN tự động (nếu có);

4.2.6  Bộ điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel;

Ngoài ra, còn có các loại đầu típ, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Dịch tễ học

Vi rút IHHN đã được báo cáo ở tôm he nuôi từ các đảo thuộc Thái Bình Dương, khu vực Đông Á, Đông Nam Á và vùng Trung Đông. Hầu hết các loài tôm thuộc họ tôm he đều có thể nhiễm vi rút IHHN, IHHNV gây bệnh nghiêm trọng ở tôm thẻ xanh (P. stylirostris) (tỷ lệ chết có thể trên 90 %); ở tôm sú (P. monodon) và tôm thẻ chân trắng (L. vannamei) bệnh gây tỷ lệ dị hình và chết thấp hơn. Bệnh xảy ra ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm nuôi.

Cơ quan đích của vi rút bao gồm: mang, biểu mô dưới vỏ, các mô liên kết, cơ quan tạo máu, cơ quan bạch huyết, tuyến râu và dây thần kinh dưới bụng. Vi rút lây truyền theo cả chiều dọc và chiều ngang.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Tôm bệnh do IHHNV có biểu hiện hôn mê, hoạt động yếu, chùy biến dạng, lúc sắp chết thường chuyển màu xanh, cơ ở phần bụng có màu trắng đục. Tôm thẻ chân trắng thường biểu hiện hội chứng dị hình, an-ten quăn queo, vỏ kitin xù xì hoặc biến dạng. Hệ số còi cọc trong đàn tôm giống của tôm thẻ chân trắng bị bệnh thường từ 10 % đến 30 %, khi bệnh nặng có thể lên đến 50 %. Sự lây nhiễm vi rút này trên tôm sú cũng gây ra hội chứng biến dạng làm tôm chậm lớn, kích thước nhỏ và biến dạng lớp kitin.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

CHÚ THÍCH: Các bước thực hiện quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu do vi rút IHHN trong phòng thí nghiệm được thực hiện theo Phụ lục C. Tất cả các thao tác liên quan đến xử lý mẫu, chiết tách ADN, phát hiện vi rút bằng phương pháp realtime PCR và PCR phải được tiến hành trong buồng cấy an toàn sinh học cấp 2 (xem 4.1.2).

6.1  Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

6.1.1  Lấy mẫu

- Ấu trùng và hậu ấu trùng: Thu nguyên con, lượng mẫu ít nhất khoảng 50 mg/mẫu.

- Tôm trưởng thành và tôm bố mẹ: Thu nguyên con, hoặc thu các loại mẫu: mang, máu, chân bơi và đuôi. Mẫu có thể được gộp từ 1 mẫu đến 5 mẫu thành 1 mẫu xét nghiệm.

Mẫu bệnh phẩm phải được lấy vô trùng, các bộ phận phải để riêng biệt trong từng túi hay lọ vô trùng và được cố định trong cồn 90 % (3.1.1) theo tỉ lệ mẫu : cồn (1:10) hoặc mẫu tươi, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và chuyển đến phòng thí nghiệm trong 48 h sau khi lấy mẫu. Mẫu tươi chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80 °C hoặc được cố định trong cồn từ 96 % đến 100 % (3.1.1) theo tỉ lệ mẫu và cồn (1:10) bảo quản ở nhiệt độ phòng.

6.1.2  Xử lý mẫu bệnh phẩm

Tạo huyễn dịch 10% từ mẫu bệnh phẩm nghiền (4.1.4) trong dung dịch PBS (3.1.2) vô trùng (ví dụ: nghiền 1 g mẫu bệnh phẩm trong 9 ml dung dịch PBS (3.1.2)). Sau đó ly tâm 2500 g trong 15 phút bằng máy ly tâm (4.2.2). Thu dịch nổi để chẩn đoán phát hiện vi rút IHHN bằng realtime PCR và PCR.

6.2  Phát hiện vi rút IHHN

6.2.1  Phương pháp realtime PCR

6.2.2.1  Nguyên tắc

Phản ứng realtime PCR phát hiện vi rút IHHN dựa trên cơ sở xác định đoạn ADN đích của vi rút được khuếch đại. Đây là phản ứng sàng lọc phát hiện vi rút IHHN. Nếu kết quả xét nghiệm âm tính thì kết luận mẫu âm tính với vi rút IHHN, nếu kết quả dương tính thì thực hiện tiếp phản ứng PCR để phân biệt typ của vi rút IHHN.

LƯU Ý: Nên tiến hành xét nghiệm sàng lọc bằng phản ứng realtime PCR để phát hiện vi rút IHHN trước.

6.2.1.2  Chiết tách ADN

Tiến hành mẫu chiết tách ADN từ các mẫu đã được xử lý (6.1.2). Ví dụ sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96 1), hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách ADN vi rút (tham khảo Phụ lục B).

Sau khi chiết tách, ADN được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản âm 20 °C hoặc âm 80 °C chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

6.2.1.3  Tiến hành phản ứng

Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục D.

Phản ứng realtime PCR phát hiện vi rút IHHN sử dụng mồi xuôi IHHNV1608F, mồi ngược IHHNV 1688R và đoạn dò Taqman Probe IHHNV-p.

Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 20 µM và đoạn dò ở nồng độ 6 µM với nước tinh khiết không có DNAse/RNAse (3.2.3).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime PCR phát hiện vi rút IHHN theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum^® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-017 ²⁾ của hãng Invitrogen.

6.2.1.4  Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ẫu không có giá trị Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35 ≤ Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.

LƯU Ý: Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

6.2.2  Phương pháp PCR

6.2.2.1  Nguyên tắc

Phương pháp PCR được thực hiện sau khi có kết quả của phản ứng realtime PCR là dương tính hoặc được thực hiện trực tiếp sau khi tách chiết ADN. Phản ứng này để phân biệt các dạng typ của vi rút IHHN bằng cách sử dụng cặp mồi 309F/309R (phát hiện vi rút IHHN typ gây bệnh: typ 1 và 2 và cặp mồl MG831F/MG831R (phát hiện vi rút IHHN typ không gây bệnh: typ 3A/ 3B và một phần đoạn gen của P. monodon (đoạn chèn của vi rút này vào gen của vật chủ P. monodon)).

6.2.2.2  Chiết tách ADN

Xem 6.2.1.2.

6.2.2.3  Tiến hành phản ứng

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo Phụ lục E.

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 309F/R và cặp mồi MG831F/R. Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 10 µM với nước sạch DNAse/RNAse (3.2.3).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng PCR theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix HotstarTaq^®Master Mix, Catalogue Number: 203445 Thực hiện điện di sản phẩm: Sau khi kết thúc chương trình chạy máy PCR (4.2.1), lấy các ống chứa sản phẩm khuếch đại ra khỏi máy PCR và giữ ở 4 °C để chuẩn bị cho quá trình điện di.

7  Kết luận

Tôm được xác định là mắc bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu khi thể hiện các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và đồng thời có kết quả xét nghiệm dương tính với phản ứng realtime PCR và PCR (cặp mồi 309F/309R) hoặc kết quả xét nghiệm dương tính với phản ứng PCR (cặp mồi 309F/309R).

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A  Dung dịch muối đệm phốt phát pH ~ 7,2 (PBS)

A.1  Thành phần

A.2  Cách chuẩn bị

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

B.2  Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

- Hút 200 µl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 µl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 µl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 µl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 µl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 µl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

Phụ lục C

(Quy định)

Sơ đồ chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu trong phòng thí nghiệm

Hình C.1 - Sơ đồ chẩn đoán bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu trong phòng thí nghiệm

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phát hiện vi rút IHHN bằng phương pháp realtime PCR

D.1  Trình tự cặp mồi, đoạn dò

Bảng D.1 - Trình tự cặp mồi, đoạn dò

D.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

- Sử dụng cặp mồi, đoạn dò đã chuẩn bị và bộ kít thương mại theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum^® Quantitative PCR SuperMix - UDG, Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen (thành phần bao gồm: Taq ADN polymerase, Tris-HCl, KCl, 6 mM MgCl₂, 400 µM dGTP, 400 µM dATP, 400 µM dCTP, 800 µM dUTP, uracil ADN glycosylase (UDG)).

- Pha hỗn hợp nhân gen (Master mix) theo hướng dẫn của bộ kít.

- Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp Master mix tiến hành:

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml;

+ Cho 5 µl ADN mẫu vừa chiết tách vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix;

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng realtime PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi rút IHHNV (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút IHHNV) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (20 µl hỗn hợp Master mix và 5 µl) vào máy realtime PCR (4.2.1) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng realtime PCR.

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng realtime PCR

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

Phụ lục E

(Tham khảo)

Phát hiện và phân biệt typ vi rút IHHN bằng phương pháp PCR

E.1  Trình tự mồi

Bảng E.1 - Trình tự mồi

E.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

- Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kít nhân gen PCR. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix HotstarTaq^®Master Mix, Catalogue Number: 203445 của hãng Qiagen (thành phần bao gồm: HotStarTaq ADN Polymerase, PCR Buffer (với 3 mM MgCl₂) và 400 µM dNTP).

- Tổng thể tích của phản ứng PCR là 25 µl (20 µl hỗn hợp Master mix và 5 µl mẫu ADN):

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 5 µl ADN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi rút IHHNV (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút IHHNV) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (hỗn hợp Master mix và mẫu ADN) vào máy PCR (4.2.1) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR.

Bảng E.2 - Thành phần phản ứng PCR

Bảng E.3 - Chu trình nhiệt phản ứng PCR

E.3  Điện di sản phẩm PCR

+ Chuẩn bị thạch 1,5 %: cho 1,5 g agarose (3.2.4) vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, bổ sung thêm 100 ml TBE 0,5X, đun dung dịch thạch trong lò vi sóng và mang ra lắc nhẹ sau mỗi 30 giây cho đến khi thạch tan hoàn toàn. Mang lọ thạch ra khỏi lò vi sóng và đợi đến khi nhiệt độ thạch bên trong lọ giảm xuống còn khoảng 50 °C.

+ Cho 2,5 µl Gelred (3.2.5) vào 25 ml thạch 1,5 % (thể tích này sử dụng cho 17 hoặc 25 giếng) và lắc đều nhẹ nhàng để Gelred hòa tan hoàn toàn, tránh tạo bọt khí. Sau đó đổ thạch vào khuôn đã có gắn sẵn lược, chờ khoảng 1 giờ để thạch đông.

+ Khi bản thạch đã đông, nhẹ nhàng lấy lược ra và tránh làm vỡ thạch. Đặt thạch vào bồn điện di có chứa dung dịch TBE 1X, phải đảm bảo dung dịch TBE ngập khỏi bản thạch.

+ Các sản phẩm PCR được pha với dung dịch nạp mẫu (3.2.6). Sau đó cho hỗn hợp này vào giếng thạch.

+ Hút 7 µl thang chuẩn ADN (3.2.7) cho vào giếng cuối cùng.

+ Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V - 100 V.

+ Sau khi điện di xong, chụp ảnh và ghi nhận kết quả.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCCS 02:2016/TY-TS: Tiêu chuẩn cơ sở quy trình phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime PCR và PCR.

[2] RAHO6_V615-11:2017. Quy trình phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) trên tôm bằng kỹ thuật realtime PCR và PCR.

[3] OIE. 2018. Infection with infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals (OIE Aquatic Manual 2017, chapter 2.2.4).