TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12709-2-3:2019

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH CÔN TRÙNG VÀ NHỆN NHỎ HẠI THỰC VẬT

PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI MỌT CỨNG ĐỐT (Trogoderma granarium Everts), MỌT DA VỆT THẬN (Trogoderma inclusum Leconte) VÀ MỌT DA ĂN TẠP (Trogoderma variable Ballion)

Procedure for identification of insect and mite pests

Part 2-3: Particular requirements for Khapra beetle (Trogoderma granarium Everts); Larger cabinet beetle (Trogoderma inclusum Leconte) and Warehouse beetle

(Trogoderma variable Ballion)

Lời nói đầu

TCVN 12709-2-3:2019 do Cục Bảo vệ Thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12709 Quy trình giám định côn trùng và nhện nhỏ hại thực vật gồm các phần sau đây:

Phần 1: Yêu cầu chung

Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với mọt to vòi Caulophilus oryzae (Gyllenhal)

Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với mọt thóc Sitophilus granarius Linnaeus

Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với mọt cứng đốt (Trogoderma granarium Everts), mọt da vệt thận (Trogoderma inclusum Leconte) và mọt da ăn tạp (Trogoderma variable Ballion)

Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với rệp sáp vảy San Jose’ Diaspidiotus perniciosus (Comstock) Danzig

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH CÔN TRÙNG VÀ NHỆN NHỎ HẠI THỰC VẬT

PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI MỌT CỨNG ĐỐT (Trogoderma granarium Everts), MỌT DA VỆT THẬN (Trogoderma inclusum Leconte) VÀ MỌT DA ĂN TẠP (Trogoderma variable Ballion)

Procedure for identification of insect and mite pests

Part 2-3: Particular requirements for Khapra beetle (Trogoderma granarium Everts); Larger cabinet beetle (Trogoderma inclusum Leconte) and Warehouse beetle

(Trogoderma variable Ballion)

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu về quy trình giám định mọt cứng đốt Trogoderma granarium Everts, mọt da vệt thận Trogoderma inclusum Leconte và mọt da ăn tạp Trogoderma variable Ballion hại thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các phiên bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8597: 2010. Kiểm dịch thực vật - Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng.

TCVN 12709-1: 2019. Quy trình giám định côn trùng và nhện gây hại thực vật - Phần 1: Yêu cầu chung

3  Thiết bị, dụng cụ

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thiết bị dụng cụ cơ bản dùng trong phòng thí nghiệm và các dụng cụ thiết bị sau:

3.1  Kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần

3.2  Kính hiển vi có thước đo, có độ phóng đại từ 40 lần đến 1 000 lần

3.3  Bàn gia nhiệt có dải nhiệt từ 20°C đến 100 °C

3.4  Tủ định ôn có dải nhiệt từ 0 °C đến 50 °C.

3.5  Tủ sấy có dải nhiệt từ 0 °C đến 100 °C

3.6  Tủ lạnh có dải nhiệt từ -5 °C đến 10 °C

3.7  Máy sàng côn trùng

3.8  Bộ sàng côn trùng có đường kính mắt sàng 1,4 mm; 2,0 mm; 2,8 mm

3.9  Túi đựng mẫu

3.10  Ống nghiệm có nắp

3.11  Hộp nhựa có nắp lưới (diện tích mắt lưới 1 cm² có từ 630 mắt lưới đến 700 mắt lưới)

3.12  Dụng cụ thủy tinh cốc thuỷ tinh có dung tích thích hợp; ống nghiệm thủy tinh có đường kính 2 cm.

3.13  Lọ thủy tinh nút mài dung tích thích hợp.

3.14  Kim côn trùng đầu nhọn và đầu gập (dạng chữ L).

3.15  Lam

3.16  Lamen

3.17  Đèn cồn

3.18  Bình thủy tinh chống ẩm

3.19  Hộp đựng mẫu

3.20  Hộp đựng mẫu lam

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích và nước cất, trừ khi có quy định khác.

4.1  Dung dịch Natri Hydroxit (NaOH) 10 % hoặc Kali Hydroxit (KOH) 10 % (xem A.1 của TCVN 12709- 1: 2019)

4.2  Kali xyanua (KCN) tinh thể

4.3  Cồn (C2H60) 99,8 %

4.4  Dung dịch cồn (C2H60) 70 % (xem A.2 của TCVN 12709-1: 2019)

4.5  Dung dịch Hoyer’s (xem A. 15 của TCVN 12709-1: 2019)

4.6  Bôm Canada

4.7  Keo dính mẫu

4.8  Dung dịch Formalin - glycerol (FG) (xem A.17 của TCVN 12709-1: 2019)

4.9  Dung dịch tổng hợp (xem A.18 của TCVN 12709-1: 2019)

4.10  Fluon

5  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1  Lấy mẫu

- Lấy mẫu theo TCVN 8597: 2010

- Mẫu hàng hóa: bảo quản trong các hộp nhựa có nắp lưới (3.11). Thành phía trong của hộp nhựa (1/3 khoảng cách tính từ trên nắp xuống) được phủ một lớp fluon (4.10) chất ngăn trưởng thành bò lên nắp. Các lọ có dán nhãn ký hiệu mẫu và đặt trong các tủ đựng mẫu lưu ở điều kiện nhiệt độ phòng.

- Thu các giai đoạn phát dục (trưởng thành, sâu non, nhộng) dựa vào ký chủ và triệu chứng gây hại: Mọt cứng đốt (Trogoderma granarium), mọt da vệt thận (Trogoderma inclusum) và mọt da ăn tạp (Trogoderma variable) có thể gây hại trên rất nhiều loại hàng hóa khô có nguồn gốc động vật hay thực vật bảo quản (xem phụ lục A). Sâu non mọt cứng đốt, mọt da vệt thận, mọt da ăn tạp thường đục sâu vào hạt và để lại các vết tổn thương trên bề mặt hạt. Triệu chứng để nhận biết các loài này trên sản phẩm bảo quản là những sợi lông tơ và xác lột của chúng trên các kẽ bao bì hoặc vật liệu bao gói. Đôi khi cũng có thể bắt gặp sâu non và trưởng thành bò trên mặt hàng hóa. Vì vậy, có thể thu sâu non, nhộng, trưởng thành của các loài này bằng sàng hoặc thu trực tiếp:

+ Sàng mẫu: Dùng máy sàng côn trùng (3.7) hoặc bộ sàng côn trùng (3.8) với kích thước mắt sàng phù hợp để thu bắt sâu non và trưởng thành trong hàng hóa.

+ Kiểm tra và thu trực tiếp:

Tách thu sâu non từ hàng hóa bảo quản có triệu chứng hại như vết đục.

Kiểm tra thu sâu non và trưởng thành của mọt tại các khe, kẽ bao bì đóng gói, kệ hàng, khe kẽ hở trên sàn, tường, trần nhà, hầm tàu..., đặc biệt chú ý tới những điểm có dấu vết lông, xác lột...

5.2  Xử lý mẫu

5.2.1  Mẫu sử dụng cho định loại bằng phương pháp quan sát đặc điểm hình thái hoặc bảo quản

- Đối với trưởng thành mọt cứng đốt, mọt da vệt thận và mọt ăn tạp: trước khi giám định hoặc bảo quản, cá thể trưởng thành được làm chết bằng phương pháp sử dụng lọ độc hoặc xử lý lạnh.

Phương pháp xử lý bằng lọ độc: Mau thu được cho vào lọ độc, đậy nắp kín để trong 2 giờ. Cách làm lọ độc xem TCVN 12709-1:2019, điều 5.2.1

Xử lý lạnh: Mẫu thu được cho vào trong túi đựng mẫu (3.9) hoặc ống nghiệm có nắp (3.10) bỏ trong ngăn đá tủ lạnh (3.6) từ 1 giờ đến 3 giờ.

- Đối với sâu non, nhộng mọt cứng đốt, mọt da vệt thận và mọt ăn tạp: trước khi giám định hoặc bảo quản được làm chết bằng phương pháp xử lý lạnh hoặc xử lý bằng nước nóng.

Phương pháp xử lý lạnh: Mẫu thu được cho vào trong túi đựng mẫu (3.9) hoặc ống nghiệm có nắp (3.10) bỏ trong ngăn đá tủ lạnh (3.6) từ 1 giờ đến 3 giờ.

Xử lý bằng nước nóng: Cho mẫu vào cốc thủy tinh (3.12) và đổ trực tiếp nước nóng 100 °C lên mẫu và để trong thời gian từ 3 phút đến 7 phút.

- Mẫu hàng hóa: bảo quản trong các hộp nhựa có nắp lưới (3.11). Thành phía trong của hộp nhựa (1/3 khoảng cách tính từ trên nắp xuống) được phủ một lớp fluon (4.10) chất ngăn trưởng thành bò lên nắp. Các hộp nhựa có dán nhãn ký hiệu mẫu và đặt trong các tủ đựng mẫu lưu ở điều kiện nhiệt độ phòng.

5.2.2  Mẫu sử dụng cho định loại bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR hoặc Realtime - PCR)

Trưởng thành và sâu non được ngâm trực tiếp trong cồn 99,8 % (4.3).

5.3  Bảo quản

- Mẫu hàng hóa (lúa mỳ, bột): bảo quản trong các hộp nhựa có nắp lưới (3.11). Thành phía trong của hộp nhựa (1/3 khoảng cách tính từ trên nắp xuống) được phủ một lớp fluon (4.10) chất ngăn trưởng thành bò lên nắp. Các hộp nhựa có dán nhãn ký hiệu mẫu và đặt trong các tủ đựng mẫu lưu ở điều kiện nhiệt độ phòng.

- Đối với trưởng thành mọt cứng đốt, mọt da vệt thận và mọt ăn tạp: Các cá thể trưởng thành sau khi được xử lý để trong tủ sấy (3.5) ở nhiệt độ 40 °C đến 45 °C từ 5 ngày đến 7 ngày. Chuyển mẫu vào lọ thủy tinh nút mài (3.13) đặt trong bình thủy tinh chống ẩm (3.18) hoặc trong hộp đựng mẫu (3.19). Các mẫu được lưu giữ trong phòng tiêu bản có nhiệt độ nhỏ hơn 20 °C, ẩm độ nhỏ hơn 50 % hoặc trong tủ định ôn (3.4).

- Đối với sâu non, nhộng mọt cứng đốt, mọt da vệt thận và mọt ăn tạp: Các cá thể sau non, nhộng sau khi được xử lý được cho vào các lọ nút thủy tinh mài (3.13) chứa dung dịch Formalin - glycerol (FG) (4.8) hoặc dung dịch tổng hợp (4.9).

- Đối với tiêu bản lam : Tiêu bản lam được dán nhãn, để trong hộp đựng mẫu lam (3.20) và đặt trong phòng tiêu bản có nhiệt độ nhỏ hơn 20 °C, ẩm độ không khí nhỏ hơn 50 % , hoặc trong tủ định ôn (3.4).

- Mẫu dùng cho định loại bằng phương pháp sinh học phân tử: Trưởng thành và sâu non được ngâm trực tiếp trong cồn 99,8 % (4.3).

6  Giám định

6.1  Giám định bằng các đặc điểm hình thái

Giám định mọt cứng đốt, mọt da vệt thận và mọt da ăn tạp bằng phương pháp quan sát các đặc điểm hình thái dưới kính lúp soi nổi (3.1) và kính hiển vi (3.2). Định loại đến loài đối với mẫu giám định là pha sâu non tuổi 4 và pha trưởng thành.

6.1.1  Pha sâu non

6.1.1.1  Làm tiêu bản lam

Bước 1: Xử lý mẫu lam tiêu bản

- Cho sâu non cần giám định vào ống nghiệm thủy tinh (3.12) chứa 5 ml dung dịch Natri Hydroxit (NaOH) 10 % hoặc Kali Hydroxit (KOH) 10 % (4.1) đun trên đèn cồn (3.17) từ 15 phút đến 20 phút (vừa đun vừa lắc ống nghiệm); hoặc cho mẫu vào cốc thủy tinh (3.12) có chứa 10 ml dung dịch Natri Hydroxit (NaOH) 10 % hoặc Kali Hydroxit (KOH) 10 % (4.1) đun trên bàn gia nhiệt (3.3) ở 60 °C từ 15 phút đến 20 phút.

- Vớt mẫu đã xử lý ra, đặt vào một giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) hoặc nước cất trên lam (3.15). Các thao tác thực hiện dưới kính lúp soi nổi (3.1).

Bước 2 : Dùng kim côn trùng tách lấy bộ phận cần quan sát

- Tiêu bản râu đầu và nốt cảm ứng

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) tách nhẹ lấy phần đầu

+ Tách rời hàm trên

+ Tách râu đầu ra khỏi hốc râu (chú ý không làm mất lông ở đốt thứ 1).

+ Tách riêng phần môi trên

+ Đặt râu đầu và phần môi trên lên lam (3.15)

- Tiêu bản đường liên lưng và lông mũi mác

+ Tách rời 4 đốt bụng cuối.

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) xẻ dọc màng đốt bụng bỏ phần da bụng

+ Dùng kim côn trùng đầu gập (3.14) gạt sạch những túm lông mũi mác ở trên lưng

+ Tách riêng lông mũi mác

+ Chuyển 4 đốt bụng cuối đã gạt sạch lông và lông mũi mác đưa lên lam (3.15)

Bước 3: Chuyển bộ phận giải phẫu cần quan sát lên lam

+ Đặt lam (3.15) dưới kính lúp soi nổi (3.1) và nhỏ 1 giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) vào giữa lam (3.15).

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) chuyển phần bộ phận giải phẫu cần quan sát như bước 2 lên giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) và chỉnh tiêu bản trên lam (3.15).

Bước 4 : Đậy lamen

Đặt lamen (3.16) tạo góc 45° từ từ hạ xuống sao cho mẫu trên lam (3.15) không có bọt khí. Dùng kim côn trùng đầu gập (3.14) ấn nhẹ lên lamen (3.16) để giữ mẫu và làm cho dung dịch tràn đều.

CHÚ THÍCH 1: Đối với tiêu bản soi ngay, tiêu bản lam sau khi hoàn thành được đặt trên bàn gia nhiệt (3.3) làm khô ở 30 °C đến 45 °C trong 2 giờ.

CHÚ THÍCH 2: Đối với tiêu bản bảo quản trong thời gian dài, tiêu bản lam sau khi hoàn thành được đặt trên bàn gia nhiệt (3.3) làm khô ở 30 °C đến 45 °C từ 4 tuần đến 6 tuần.

6.1.1.2  Trình tự giám định

- Quan sát hình thái sâu non: hình dạng, màu sắc, đường liên lưng, dưới kính lúp soi nổi (3.1)

- Quan sát tiêu bản lam phần miệng, lông mũi mác, chân sâu non và đốt bụng dưới kính hiển vi (3.2).

- So sánh các đặc điểm quan sát được với khóa phân loại của sâu non các loài mọt thuộc giống Trogoderma (điều 6.1.1.3).

6.1.1.3  Các đặc điểm hình thái giám định pha sâu non

- Đặc điểm định loại pha sâu non giống Trogoderma

1. Đốt bụng 9 có gai, đốt bụng 10 hóa cứng, dạng trụ tròn………………..không phải Trogoderma

Đốt bụng 9 không có gai, đốt bụng 10 không hóa cứng………………………………………………2

2. Lưng không có lông mũi mác, xúc biện có 4 đốt…………………………không phải Trogoderma

Lưng có lông mũi mác, xúc biện có 3 đốt………………………………………………………………3

3. Mặt lưng đốt bụng sau có hoa văn không đều, đốt bụng 8 không có tủm lông mũi mác ……………………………………………………………………………………không phải Trogoderma

Mặt lưng đốt bụng sau không có hoa văn, đốt bụng 8 có túm lông mũi mác……………………….4

4. Đốt thứ 2 của râu đầu dài gấp 2 lần chiều dài của đốt cuối, chiều dài của mũi mác dài ít nhất gấp 3 lần chiều rộng của mũi mác……………………………………………không phải Trogoderma

Đốt thứ 2 của râu đầu dài gần bằng đốt cuối, chiều dài đỉnh của lông mũi mác dài ít hơn 3 lần chiều rộng của mũi mác………………………………………………………………..Trogoderma spp.

Cho đến nay chưa có khóa định loại cho tất cả các loài thuộc giống Trogoderma. Tổng hợp một số tài liệu của Banks, 1994 và Gorham, 1991 pha sâu non của giống Trogoderma có một số đặc điểm chính như sau:

(1) Cơ thể có hình trụ, chiều dài gấp 6 lần chiều rộng, 2 mép bên cơ thể gần như song song ở phần giữa

(2) Đầu rất phát triển, mảnh đầu hóa kitin cứng, hàm dưới nhô ra

(3) Có 3 đôi chân

(4) Có gai ở gần móng chân ngực

(5) Có 3 loại lông trên cơ thể: lông cứng, lông mũi mác và lông gai

(6) Đỉnh của lông mũl mác có chiều dài gấp 3 lần so với chiều rộng

(7) Có gai đuôi

- Đặc điểm nhận dạng đến loài của pha sâu non

+ Mọt cứng đốt Trogoderma granarium Everts

Sâu non tuổi 1 dài từ 1,6 mm đến 1,8 mm, rộng từ 0,25 mm đến 0,3 mm. Sâu non tuổi 4 (hình 1) đẫy sức dài 6 mm, rộng 1,5 mm.

Cơ thể có màu vàng đậm, hình trụ, hai đầu thon nhỏ, toàn thân phủ nhiều lông, mút cuối của đuôi có một túm lông dài không quá chiều dài của 3 đến 4 đốt bụng cuối. Đầu và lông màu nâu, râu đầu 3 đốt (hình 2). Trên đốt bụng 9 có hai túm lông dày và dài. Kích thước tăng dần và màu sắc sẫm dần theo các tuổi.

Cơ thể có 3 loại lông là lông cứng, lông gai và lông mũi mác (hình 4).

Đốt cuối của râu đầu có ít nhất 1 lỗ cảm giác nằm ở vị trí 1/4 về phía gốc.

Giữa hai xương của môi trên có 4 nốt cảm ứng (hình 3).

Mặt lưng đốt bụng 8 không có đường liên lưng (hình 5).

Ngực có 3 đốt, mỗi đốt mang một đôi chân, móng chân có hai gai nhọn (một gai dài, một gai ngắn và gai dài lớn gấp hai lần gai ngắn).

Hình 1 - Sâu non tuổi 4 mọt cứng đốt

(NGUỒN: PQDC, 2015)

+ Mọt da vệt thận Trogoderma inclusum Leconte

Sâu non tuổi 1 dài từ 1,6 mm đến 1,8 mm, rộng từ 0,25 mm đến 0,3 mm. Sâu non tuổi 4 đẫy sức dài 6,5 mm, rộng 1,5 mm.

Cơ thể có màu vàng đậm, hình trụ, hai đầu thon nhỏ, toàn thân phủ nhiều lông, mút cuối của đuôi có một túm lông dài không quá chiều dài của 3 đến 4 đốt bụng cuối. Đầu và lông màu nâu, râu đầu 3 đốt (hình 6). Trên đốt bụng 9 có hai tủm lông dày và dài. Kích thước tăng dần và màu sắc sẫm dần theo các tuổi.

Cơ thể có 3 loại lông là lông cứng, lông gai và lông mũi mác (hình 8).

Đốt thứ nhất của râu đầu có 9 lông cứng mọc về một phía, đốt thứ hai không thu hẹp về phía đỉnh, đốt thứ ba dài bằng đốt hai và nhỏ hơn về phía đỉnh.

Giữa hai xương của môi trên có 6 nốt cảm ứng (hình 7).

Mặt lưng đốt bụng thứ 8 có đường liên lưng (hình 9).

Ngực có 3 đốt, mỗi đốt mang một đôi chân, mỏng chân có hai gai nhọn (một gai dài, một gai ngắn và gai dài lớn gấp hai lần gai ngắn).

+ Mọt da ăn tạp Trogoderma variable Ballion

Sâu non tuổi 1 dài từ 1,6 mm đến 1,8 mm, rộng từ 0,25 mm đến 0,3 mm. Sâu non tuổi 4 (hình 10) đẫy sức dài 6,3 mm, rộng 1,5 mm.

Cơ thể có màu vàng đậm, hình trụ, hai đầu thon nhỏ, toàn thân phủ nhiều lông, mút cuối của đuôi có một túm lông dài không quá chiều dài của 3 đến 4 đốt bụng cuối. Đầu và lông màu nâu, râu đầu 3 đốt (hình 11). Trên đốt bụng 9 có hai túm lông dày và dài. Kích thước tăng dần và màu sắc sẫm dần theo các tuổi.

Cơ thể có 3 loại lông là lông cứng, lông gai và lông mũi mác (hình 13).

Giữa hai xương của môi trên có 6 nốt cảm ứng (hình 12).

Đốt đỉnh râu đầu của không có nốt cảm ứng nằm ở 1/4 chân đốt.

Mặt lưng đốt bụng thứ 8 không có đường liên lưng (hình 14).

Hình 10 - Sâu non tuổi 4 mọt da vệt thận

(NGUỒN: ISPM27)

6.1.2  Pha trưởng thành

6.1.2.1  Làm tiêu bản lam

Bước 1: Xử lý mẫu làm tiêu bản lam

- Cho trưởng thành cần giám định vào ống nghiệm thủy tinh (3.12) chứa 5 ml dung dịch Natri Hydroxit (NaOH) 10 % hoặc Kali Hydroxlt (KOH) 10 % (4.1) đun trên đèn cồn (3.17) từ 15 phút đến 20 phút (vừa đun vừa lắc ống nghiệm); hoặc cho mẫu vào cốc thủy tinh (3.12) có chứa 10 ml dung dịch Natri Hydroxit (NaOH) 10 % hoặc Kali Hydroxit (KOH) 10 % (4.1) đun trên bàn gia nhiệt (3.3) ở 60 °C từ 15 phút đến 20 phút.

- Vớt mẫu đã xử lý ra, đặt vào một giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) hoặc nước cất trên lam (3.15). Các thao tác thực hiện dưới kính lúp soi nổi (3.1).

Bước 2 : Dùng kim côn trùng tách lấy bộ phận cần quan sát

- Tiêu bản râu đầu

+ Luồn kim côn trùng đầu nhọn (3.14) qua phần hốc râu đầu, tách râu.

- Tiêu bản hốc râu đầu

+ Sau khi tách lấy râu đầu chuyển cả phần ngực lên lam (3.15).

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) tách một phần giữa của mảnh lưng ngực bỏ đi.

- Tiêu bản mảnh cằm

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) tách rời mảnh lưng ngực và đầu.

+ Tách riêng đầu, luồn kim côn trùng đầu nhọn (3.14) qua lỗ miệng tách rời hàm trên, tách riêng phần dưới (cả cằm và môi dưới).

+Tách riêng cằm

- Tiêu bản cánh cứng

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) cắm vào giữa mảnh thuẫn và nhẹ nhàng tách rời đôi cánh cứng.

+ Đặt mặt lưng (đặt úp) trên lam (3.15).

- Tiêu bản cánh màng

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) tách nhẹ phần gốc cánh màng.

+ Khi chuyển lên lam (3.15) cần di chuyển nhẹ nhàng, tránh làm rách cánh. Cánh phải được căng thẳng, phần gân chính cánh nằm phía trên.

- Tiêu bản bộ phận sinh dục cái

+ Tách riêng phần bụng, dùng côn trùng đầu nhọn (3.14) xẻ màng đốt dọc theo một bên sườn. Bộ phận sinh dục cái nằm ở hai đốt bụng cuối.

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) tách riêng ống đẻ trứng, buồng trứng, túi chứa tinh, lấy hai gai xương có hình răng cưa.

- Tiêu bản bộ phận sinh dục đực

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) ấn vào phần cuối bụng, gạt nhẹ để bộ phận sinh dục của con đực trôi ra.

+ Tách 2 đốt bụng cuối, tách tấm gai xương và gai giao cấu.

- Tiêu bản đốt bụng 8 đối với trưởng thành cái

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) ấn nhẹ ở đốt bụng cuối cùng, kéo nhẹ, tách rời khỏi ống đẻ trứng.

Bước 3: Chuyển bộ phận giải phẫu cần quan sát lên lam

+ Đặt lam (3.15) dưới kính lúp soi nổi (3.1) và nhỏ 1 giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) vào giữa lam (3.15).

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) chuyển bộ phận giải phẫu cần quan sát đã tách rời như bước 2 lên giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) và chỉnh tiêu bản trên lam.

Bước 4 : Đậy lamen

Đặt lamen (3.16) tạo góc 45° từ từ hạ xuống sao cho mẫu trên lam (3.15) không có bọt khí. Dùng kim côn trùng đầu gập (3.14) ấn nhẹ lên lamen (3.16) để giữ mẫu và làm cho dung dịch tràn đều.

CHÚ THÍCH 1: Đối với tiêu bản soi ngay, tiêu bản lam sau khi hoàn thành được đặt trên bàn gia nhiệt (3.3) làm khó ở 30 °C đến 45 °C trong 2 giờ.

CHÚ THÍCH 2: Đối với tiêu bản bảo quản trong thời gian dài, tiêu bản lam sau khi hoàn thành được đặt trên bàn gia nhiệt (3.3) làm khô ở 30 °C đến 45 °C từ 4 tuần đến 6 tuần.

6.1.2.2  Trình tự giám định

- Quan sát hình thái trưởng thành dưới kính lúp soi nổi (3.1). Quan sát hoa văn trên cánh cứng, hốc râu đầu, đốt bàn chân.

- Quan sát các lam tiêu bản dưới kính hiển vi (3.2). Lam tiêu bản râu đầu, mảnh cằm, cánh màng, bộ phận sinh dục (đực và cái), đốt bụng số 8 (trưởng thành cái).

- So sánh các đặc điểm hình thái quan sát được với khóa phân loại của trưởng thành các loài mọt thuộc giống Trogoderma (điều 6.1.2.3).

6.1.2.3  Các đặc điểm hình thái giám định pha trường thành

- Đặc điểm giám định pha trưởng thành giống Trogoderma

1. Kích thước cơ thể dài hơn 4,5 mm hoặc ngắn hơn 1,5 mm……………Không phải Trogoderma

Kích thước cơ thể dài từ 1,5 mm đến 4,5 mm…………………………………………………………2

2. Trán không có mắt đơn …………………………………..………………. Không phải Trogoderma

Trán có mắt đơn…………………………………………………………………………………………..3

3. Râu đầu 11 đốt, từ 3 đến 8 đốt không có đốt nào dạng hình chùy….. Không phải Trogoderma

Râu đầu 11 đốt, từ 3 đến 8 đốt có dạng hình chùy…………………………………………………….4

4. Lông tơ trên cánh cứng có màu sắc không rõ ràng……………………. Không phải Trogoderma

Lông tơ trên cánh cứng tạo thành hình hoa văn có màu vàng đến màu nâu đỏ…………………..5

5. Đốt bàn chân thứ 4 không dài gấp 2 lần đốt bàn chân thứ 3………….. Không phải Trogoderma

Đốt bàn chân thứ 4 dài ít nhất gấp 2 lần đốt bàn chân thứ 3………………………………………..6

6. Cơ thể có màu nâu sáng, râu đầu con đực có từ 4 đến 5 đốt hình chùy, râu đầu con cái có từ 3 đến 4 đốt hình chùy, đỉnh đốt bụng 5 của con đực có đốm lông dày………Trogoderma gramarium

Cơ thể không có màu nâu sáng, râu đầu con đực có nhiều hơn 4 đến 5 đốt hình chùy, râu đầu con cái có nhiều hơn 3 đến 4 đốt hình chùy, đỉnh đốt bụng của con đực không có đốm lông dày………………………………………………………………………………………………………….7

7. Cánh cứng có hoa văn rõ ràng, râu đầu con đực có 6 đến 8 đốt hình chùy, râu đầu con cái có 4 đến 5 đốt hình chùy…………………………………………………………….Trogoderma inclusum

Cánh cứng có hoa văn rõ ràng, con đực có 6 đến 8 đốt hình chùy, con cái có 4 đến 5 đốt hình chùy, đốt đỉnh râu đầu thon dài………………………………………………………………………….8

8. Trên cánh cứng có các băng màu vàng ở phía đỉnh cánh tạo thành dạng nửa vòng tròn hoặc vòng tròn khép kín………………………………………………………………..Trogoderma variabile

Không bao gồm các đặc điểm trên…………………………………………..Không phải Trogoderma

- Đặc điểm nhận dạng pha trưởng thành đến loài

+ Mọt cứng đốt Trogoderma granarium Everts

Cơ thể hình bầu dục (hình 15), con đực dài từ 1,4 mm đến 2,3 mm, rộng từ 0,75 mm đến 1,1 mm; con cái dài từ 2,1 mm đến 3,4 mm, rộng từ 1,7 mm đến 1,9 mm.

Toàn thân phủ nhiều lông mầu vàng ánh kim, râu đầu và chân màu sáng hơn.

Đầu và mảnh lưng ngực màu nâu đậm đến đen, cánh cứng có màu nâu đỏ. Cánh màng ở vị trí S1 có tối đa 14 lông (thường có 10 lông). Bụng và ngực có màu nâu sáng, chân có màu nâu vàng.

Râu đầu kiểu chuỗi hạt từ 10 đốt đến 11 đốt, con đực (hình 18) có từ 4 đốt đến 5 đốt hình chùy, con cái (hình 19) có từ 3 đốt đến 4 đốt hình chùy, hốc râu hở (hình 16). Cằm xẻ thành hai thuỳ cong.

Có một mắt đơn ở trán giữa 2 mắt kép.

Khoảng cách giữa các đốt gốc của đôi chân giữa lớn gấp hai lần khoảng cách tương ứng của đôi chân trước.

Số lượng lông S1 của cánh màng (hình 17) có thể đến 14 lông nhỏ. Số lượng lông S2 có từ 2 lông đến 5 lông nhỏ hoặc không có.

Bụng có màu nâu vàng

Cơ quan sinh dục của con đực (hình 21) có hai lưỡi hái cong, nhọn, nối với nhau bằng cầu ngang, chiều rộng của cầu ngang bằng 1/2 chiều rộng của ống phóng tinh, mép trên của cầu ngang thẳng, mép dưới cong.

Cơ quan sinh dục cái (hình 20) mặt trong của gai giao cấu của cơ quan sinh dục cái cỏ từ 10 răng cưa đến 15 răng cưa.

Hình 15 - Trưởng thành mọt cứng đốt

(NGUỒN: ISPM 27)

+ Mọt da vệt thận Trogoderma inclusum Leconte

Cơ thể hình bầu dục (hình 22), dài từ 1,8 mm đến 4,2 mm. Cánh cứng màu tối, có hoa văn rõ ràng màu vàng nhạt (hình 24).

Râu đầu kiểu chuỗi hạt 11 đốt (hình 25). Con đực có từ 6 đốt đến 8 đốt hình chùy, con cái có từ 4 đốt đến 5 đốt hình chùy, hốc râu đầu kín.

Chính giữa cằm hơi lõm. Bờ trong mắt kép lõm vào

Cơ quan sinh dục của con đực (hình 27) có cầu ngang rất hẹp

Mặt trong gai giao cấu của cơ quan sinh dục cái (hình 26) có 20 răng cưa nhọn

+ Mọt da ăn tạp Trogoderma variabile

Cơ thể hình bầu dục (hình 28), dài từ 1,8 mm đến 3,2 mm. Cánh cứng màu nâu đen (hình 30), có hoa văn rõ rang. Các băng màu trên cánh cứng có màu vàng nhạt.

Râu đầu kiểu chuỗi hạt 11 đốt. Râu đầu con đực có từ 6 đốt đến 8 đốt hình chùy, râu đầu con cái có từ 4 đốt đến 5 đốt hình chùy, hốc râu đầu kín.

Số lượng lông S1 của cánh màng (hình 31) có từ 16 lông nhỏ trở lên.

Cơ quan sinh dục của con đực (hình 33) chính giữa cầu ngang hơi lõm vào Mặt trong gai giao cấu con cái (hình 32) dạng răng cưa rất to và nhọn.

6.2  Giám định bằng sinh học phân tử

Giám định bằng sinh học phân tử đối với mọt cứng đốt sử dụng đoạn gen 16S bằng phương pháp PCR và Real-time PCR

6.2.1. Phương pháp PCR

Bước 1: Tách chiết DNA

DNA được tách chiết từ pha sâu non hoặc trưởng thành bằng kit tách chiết, ví dụ như QIAgen DNeasy Blood.

Bước 2: Khuyếch đại gen

Sử dụng đoạn gen mã hóa 16S

Bảng 1: Danh sách đoạn mồi sử dụng trong quá trình khuếch đại PCR (Simon et al.)

Thành phần chạy phản ứng khuếch đại PCR cần tổng số 25 µl phản ứng bao gồm:

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: Phản ứng được thực hiện bởi máy PCR theo chương trình như sau:

Bước 3: Đọc kết quả

Sản phẩm PCR được điện di 30 phút với 1,5 % agrose trong đệm TBE 1X. Nhuộm gen (ví dụ sử dụng: Ethidium bromide 1 pg/ml) và soi dưới tia UV.

Mẫu dương tính cho đoạn gen có kích thước 500 bp.

6.2.2  Phương pháp Real-time PCR

Bước 1: Tách chiết DNA

DNA được tách chiết từ pha sâu non hoặc trưởng thành bằng kit tách chiết, ví dụ như QIAgen DNeasy Blood.

Bước 2: Chạy phản ứng real time PCR

Thành phần chạy phản ứng real time PCR cần tổng số 25 μl bao gồm:

Bảng 2: Danh sách đoạn mồi và mẫu dò sử dụng trong quá trình chạy real time PCR (Rachel et al.)

Chu trình nhiệt của phản ứng real time PCR:

Bước 3: Đọc kết quả

Kết quả được phân tích bởi phần mềm ví dụ như phần mềm Se-AI (Rambaut 2002) và PAUP (Swofford 2002).

6.3  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là loài mọt cứng đốt hoặc mọt da vệt thận hoặc mọt da ăn tạp khi:

- Mẫu sâu non hoặc trưởng thành có đặc điểm hình thái phù hợp với các đặc điểm đã nêu ở điều 6.1.1.3 hoặc 6.1.2.3.

hoặc

- Phương pháp PCR hoặc realtime-PCR cho kết quả là dương tính.

7  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

- Thông tin về mẫu giám định.

- Tên khoa học của loài

- Phương pháp giám định

- Tài liệu giám định

Người giám định/cơ quan giám định Phiếu giám định chi tiết có thể tham khảo phụ lục B.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin dịch hại

A.1  Thông tin chung loài mọt cứng đốt Trogoderma granarium Everts

A.1.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên khoa học: Trogoderma granarium Everts

Tên tiếng Việt: Mọt cứng đốt

Vị trí phân loại:

Ngành : Arthropoda

Lớp: Insecta

Bộ: Coleoptera

Họ: Dermestidae

Giống: Trogoderma

A.1.2  Phân bố

Châu Á: Afghanistan, Bangladesh, Taiwan, India, Iran, Israel, Korea, Lebanon, Saudi Arabia, Syria, Turkey, Yemen

Châu Âu: Spain, Switzerland

Châu Mỹ: USA (New York)

Châu Phi: Algeria, Angola, Burkina Faso, Egypt, Morocco, Tunisia, Libya, Mali, Zimbabwe, Sudan, Somali, Senegal, Niger, Mauritania

A.1.3  Ký chủ

Sâu non mọt cứng đốt (Trogoderma granarium) có thể gây hại trên rất nhiều loại hàng hóa khô có nguồn gốc động vật hay thực vật bảo quản trong kho bảo quản, nhà máy chế biến thức ăn gia súc, công ty sản xuất hạt giống, nhà máy sữa khô, cửa hàng thực phẩm... Ký chủ chính của mọt cứng đốt là các họ Fabaceae: Arachis hypogaea (lạc), Cicer arietinum (đậu gà), Vigna unguiculata (đậu đũa), Vicia faba (đậu răng ngựa); họ Malvaceae: Gossypium (bông); họ Poaceae: Hordeum vulgare (đại mạch), Oryza sativa (gạo), Panicum miliaceum (kê), Sorghum bicolor (cao lương), Triticum (chi Tiểu mạch), Triticum aestivum (lúa mì), Zea mays (ngô), Pennisetum glaucum (kê trân châu); họ Pedaliaceae: Sesamum indicum (vừng); họ Asteraceae: Helianthus annuus (hướng dương).

A.1.4  Đặc điểm sinh học

- Mọt cứng đốt phát triển mạnh ở điều kiện nhiệt độ nóng ẩm, vòng đời của mọt cứng đốt khoảng từ 26 ngày đến 220 ngày, tùy thuộc vào điều kiện nhiệt độ.

- Trong điều kiện không có thức ăn, sâu non có khả năng đình dục, có thể sống được 9 tháng, trong điều kiện có thức ăn, chúng có thể sống được 6 năm. Con cái đẻ từ 59 trứng đến 90 trứng trong khoảng từ 3 ngày đến 14 ngày.

- Mọt cứng đốt có khả năng đi theo các loại hàng hoá buôn bán và hạt giống. Các vật liệu đóng gói cũng là nơi ẩn náu của loài này.

A.2  Thông tin chung loài mọt da vệt thận Trogoderma inclusum Leconte

A.2.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên khoa học: Trogoderma inclusum Leconte

Tên tiếng Việt: Mọt da vệt thận

Vị trí phân loại:

A.2.2  Phân bố

Châu Âu: Russia, Spain

Châu Mỹ: Canada, USA (Georgia, Kansas)

Châu Phi: Morocco, South Africa, Somali, Senegal, Niger, Mauritania

A.2.3  Ký chủ

Mọt da vệt thận (Trogoderma inclusum) gây hại trên ngô, các loại ngũ cốc bảo quản, bột mỳ, lạc, thức ăn gia súc.

A.2.4  Đặc điểm sinh học

- T. inclusum là loài côn trùng đặc biệt nguy hiểm đổi với hạt ngũ cốc ở Mỹ và vùng Địa Trung Hải. Loài này rất khó phòng trừ vì khi gặp điều kiện bất lợi của môi trường như quá nóng, quá lạnh, quá khô, thiếu thức ăn, sâu non có gen tiềm sinh lập tức chuyển sang trạng thái đình dục (Diapause) sâu non có khả năng chống chịu cao với thuốc hóa học.

- Loài T. inclusum có khả năng đi theo các loại hàng hóa buôn bán và hạt giống. Các vật liệu đóng gói cũng là nơi ẩn náu của loài này.

A.3  Thông tin chung loài mọt da ăn tạp Trogoderma variable Ballion

A.3.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên khoa học: Trogoderma variable Ballion

Tên tiếng Việt: Mọt da ăn tạp

Vị trí phân loại:

Ngành : Arthropoda

Lớp: Insecta

Bộ: Coleoptera

Họ : Dermestidae

Giống : Trogoderma

A.3.2  Phân bố

Châu Á: Afghanistan, China, Kazakhstan, Mongolia, Saudi Arabia, Tajikistan, Turkmenistan, Uzbekistan;

Châu Âu: Finland, Russian Federation, United Kingdom;

Châu Mỹ: Canada, Mexico, USA

Châu Phi: South Africa

Châu Đại Dương: Australia

A.3.3  Ký chủ

Mọt da ăn tạp (Trogoderma variable) gây hại chủ yếu trên các nông sản bảo quản như gạo, lúa, lúa mỳ, ngô, yến mạch, lúa mạch, các sản phẩm thuộc họ Poaceae: Avena sativa (yến mạch), Hordeum vulgare (đại mạch), Oryza sativa (gạo), Triticum (lúa mỳ), Zea mays (ngô).

A.3.4  Đặc điểm sinh học

- Mọt da ăn tạp không có khả năng chống chịu được với điều kiện nóng và khô, nhiệt độ thích hợp cho loài mọt này sinh trưởng và phát triển từ 17 °C đến 38 °C. Ở điều kiện nhiệt độ 37,5 °C và độ ẩm 20 %, sâu non của mọt da ăn tạp chết trong vòng 35 ngày.

- Sâu non mọt da ăn tạp ngừng phát dục trong điều kiện thiếu thức ăn, nhiệt độ không thuận lợi. Tuy nhiên, mức độ đình dục của mọt da ăn tạp kém hơn so với mọt cứng đốt.

- Trong điều kiện thức ăn là lúa mỳ, nhiệt độ 30 °C, độ ẩm từ 60 % đến 70 % thì vòng đời của mọt da ăn tạp là khoảng 39 ngày. Tuổi thọ của trưởng thành khoảng từ 7 ngày đến 10 ngày. Loài mọt này có khả năng đi theo các loại hàng hóa buôn bán và hạt giống. Các vật liệu đóng gói cũng là nơi ẩn náu của loài này.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hoá:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:                                        Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

7. Người lấy mẫu:

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: TCVN 12709-2-3:2019, “Quy trình giám định côn trùng và nhện nhỏ gây hại thực vật - Phần 2- 3: Yêu cầu cụ thể đối với mọt mọt cứng đốt (Trogoderma granarium Everts), mọt da vệt thận (Trogoderma inclusum LeConte) và mọt da ăn tạp (Trogoderma variable Ballion)

13. Kết quả giám định:

Tên khoa học:

Họ: Dermestidae

Bộ: Coleoptera

Thư mục tài liệu tham khảo

[1]  Nghị định 86/2012/NĐ-CP. Quy định chi tiết và hướng dẫn thi hành một số điều của luật đo lường.

[2]  QCVN 01-105.2012/BNNPTNT - Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình giám định mọt cứng đốt (Trogoderma granarium Everts) và mọt da vệt thận (Trogoderma inclusum Leconte) là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam

[3]  QCVN 01-175:2014/BNNPTNT - Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình lưu giữ, bảo quản và vận chuyển mẫu trong kiểm dịch thực vật

[4]  TCVN 1-2 : 2008, Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

[5]  Banks, H. J., 1994. Illutrated identification keys for Trogoderma granarium, T. glabrum, T. inclusum and T. variabile (Coleoptera: Dermestidae) and other Trogoderma associated with stored products.

[6]  Beal, R. S. Jr, 1960. Descriptions, Biology and Notes on the identification of some Trogogerma larvae (Coleoptera: Dermestidae).Technical Bulletin No1228.

[7] CABI, 2018. Crop Protection Compedium

(https://www.cabi.org/cpc/datasheet/55010)

(https://www.cabi.org/cpc/datasheet/55013)

(https://www.cabi.org/cpc/datasheet/55012)

[8]  Gorham J. R., 1991. Insect and mite pests in food. U. S. Government printing office. Washington, D. C. 20402. Page 115-136.

[9]  IPPC, 2012. International standards for Phytosanitary measures. ISPM 27 Diagnostic protocols. DP 3: Trogoderma granarium Everts.

[10]  OEPP/EPPO, 2002. Dianogstic protocols for regulated pests Protocoles de diagnostic pour les organisms re’glemente’s. PM 7/13 (1). Normes OEPP EPPO standards.

[11]  Olson R. L. O., Farris R. E., Bar N. B. and Cognato A. I., 2014. Molercular indentification of Trogoderma granarium (Coleoptera: Dermestidae) using the 16s gene.Journal of Pest Science 87:701- 710. Doi10.1007/s10340-0014-0621-3.

[12]  IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.