TIÊU\r\nCHUẨN QUỐC GIA

TCVN\r\n12195:2-13:2020

QUY\r\nTRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT
\r\nPHẦN 2-13: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI NẤM POLYSCYTALUM\r\nPUSTULANS (M.N. OWEN & MAKEF) M.B ELLIS

Procedure for\r\nidentification of plant disease caused by fungi
\r\nPart 2-13: Particular requirements for Polyscytalum pustulans (M.N. Owen &\r\nMakef) M.B Ellis

Lời nói đầu

TCVN 12195-2-13:2020 do Cục Bảo vệ thực\r\nvật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu\r\nchuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12195 Quy trình giám định nấm\r\ngây bệnh thực vật gồm các phần sau:

- TCVN 12195-1:2019. Phần 1: Yêu cầu\r\nchung

- TCVN 12195-2-1:2018. Phần 2-1 : Yêu\r\ncầu cụ thể đối với nấm Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz

- TCVN 12195-2-2:2018. Phần 2-2: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với nấm Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr

TCVN 12195-2-3:2018. Phần 2-3: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với nấm Claviceps africana Frederickson, Mantle & De\r\nMilliano

- TCVN 12195-2-4:2018. Phần 2-4: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với nấm Ciborinia camelliae Kohn

- TCVN 12195-2-5:2018. Phần 2-5: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với nấm Boeremia foveata (Foister) Aveskamp, Gruyter &\r\nVerkley

- TCVN 12195-2-6:2018. Phần 2-6: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với Phytophthora boehmeriae Sawada

- TCVN 12195-2-7:2019. Phần 2-7: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với nấm Tilletia indica Mitra

- TCVN 12195-2-8:2019. Phần 2-8: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với nấm Phoma tracheiphila (Perth) Kantachveli &\r\nGikachvili

- TCVN 12195-2-9:2019. Phần 2-9: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với nấm Balansia oryzae - sativae Hashioka

- TCVN 12195-2-10:2019. Phần 2-10: Yêu\r\ncầu cụ thể đối với nấm Synchytrium endobioticum (Schilb) Percival

- TCVN 12195-2-11:2019. Phần 2-11: Yêu\r\ncầu cụ thể đối với nấm Microcyclus ulei (Henn) Arx

- TCVN 12195-2-12:2020. Phần 2-12: Yêu\r\ncầu cụ thể đối với nấm Puccinia psidii G. Winter

- TCVN 12195-2-13:2020. Phần 2-13: Yêu\r\ncầu cụ thể đối với nấm Polyscytalum pustulans (M.N. Owen & Makef)\r\nM.B Ellis

QUY TRÌNH\r\nGIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT
\r\nPHẦN 2-13: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI NẤM POLYSCYTALUM PUSTULANS (M.N. OWEN\r\n& MAKEF) M.B ELLIS

Procedure for\r\nidentification of plant disease caused by fungi
\r\nPart 2-13: Particular requirements for Polyscytalum pustulans (M.N. Owen &\r\nMakef) M.B Ellis

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu cụ\r\nthể đối với quy trình giám định nấm Polyscytalum pustulans (M.N. Owen\r\n& Makef) M.B Ellis gây bệnh thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết\r\ncho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì\r\náp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12195-1:2019. Quy trình giám định\r\nnấm gây bệnh thực vật - Phần 1: Quy định chung.

3  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông\r\nthường của phòng thử nghiệm sinh học, theo TCVN 12195 - 1:2019 (điều 3) và các\r\nthiết bị sau:

3.1  Kính hiển vi: có độ phóng\r\nđại từ 40 lần đến 1 000 lần

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết\r\nphân tích, trừ khi có quy định khác, sử dụng hóa chất theo TCVN 12195-1:2019\r\n(điều 4).

5  Lấy mẫu và bảo quản\r\nmẫu

5.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN\r\n12195-1:2019.

5.2  Bảo quản mẫu giám định

Bảo quản mẫu khi giám định hoặc sau\r\nkhi giám định như sau:

+ Củ khoai tây bảo quản tươi hoặc ép khô\r\n(phần vỏ củ) theo điều 5.2.1 của TCVN 12195-1:2019

+ Tiêu bản lam giám định theo điều\r\n5.2.4 của TCVN 12195-1:2019

6  Phát hiện bệnh

Triệu chứng bệnh do nấm Polyscytalum\r\npustulans trên củ là các đốm nhỏ màu đen hoặc tím hơi nổi lên. Các đốm này\r\ncó thể riêng lẻ hay mọc thành đám. Đốm bệnh tập trung quanh mắt củ, sẹo rễ hoặc\r\nvết thương cơ giới. Các đốm có thể ăn sâu 1 đến 2 mm vào trong thịt củ. Xung\r\nquanh các vết bệnh có thể hóa bần. (Hình 1)

Hình 1- Ví dụ\r\ntriệu chứng của nấm Polyscytalum pustulans (M.N. Owen &\r\nMakef) M.B Ellis trên củ khoai tây

Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các lô\r\nhàng có nguồn gốc tại các quốc gia mà nấm có phân bố (xem phụ lục A).

7  Giám định

7.1  Giám định bằng đặc điểm hình thái

7.1.1  Kiểm tra trực tiếp

- Quan sát hình thái của nấm thu được\r\nbằng một trong hai cách:

+ Kiểm tra mẫu tươi: theo điều 7.1.1.1\r\ncủa TCVN 12195-1:2019

+ Cố định tiêu bản lam: Làm tiêu bản\r\nlam theo điều 7.1.1.2 của TCVN 12195-1:2019

- Quan sát dưới kính hiển vi (3.1) đặc\r\nđiểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm Polyscytalum\r\npustulans (M.N. Owen & Makef) M B Ellis (điều 7.1.2).

7.1.2  Đặc điểm định loại hình thái của\r\nnấm Polyscytalum pustulans (M.N. Owen & Makef) VLB Ellis

Tản nấm trên môi trường màu trắng tới\r\nxám. Cành bào tử kích thước (2 đến 4) μm x 14 μm. Phần gốc cành bào tử có màu nâu nhạt, đôi\r\nkhi có thể phình to. Bào tử phân sinh không màu, nhẵn, hình ống và thường không\r\nphân bào, kích thước (6 đến 8) μm x (2 đến 3) μm. Bào tử phân sinh tạo thành\r\nchuỗi dễ rời rạc (hình 2)

Hình 2- Bào tử\r\nvà cành bào tử của nấm Polyscytalum pustulans (M.N. Owen & Makef)\r\nM.B Ellis

7.2  Giám định bằng\r\nphương pháp real-time PCR

7.2.1  Tách chiết DNA

DNA được tách chiết theo điều 7.2.1 của\r\nTCVN 12195-1:2019

7.2.2  Nhân gen

Các mồi sử dụng (Lee, 2009)

Forward primer PpustF1 AGCGCCCCACAGAAGCC

Reverse primer PpustR2\r\nGACCGAACTTCTCCGAGAGGT

Probe PpustPr1\r\nCGGCTCTAAACCCTACCGAAGTAGGGTAGC

Chu trình nhiệt sử dụng:

7.2.3  Đọc kết quả

Phản ứng được nhận biết là dương tính\r\nkhi xuất hiện đường cong tuyến tính thể hiện sự nhân lên của gen.

7.3  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là loài Polyscytalum\r\npustulans (M.N. Owen & Makef) M.B Ellis khi:

- Nấm có đặc điểm hình thái phù hợp với\r\ncác đặc điểm đã nêu ở điều 7.1.2.

hoặc

- Có kết quả dương tính với phương\r\npháp giám định bằng Real-time PCR

8  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm\r\nnhững thông tin cơ bản sau:

- Thông tin về mẫu giám định.

- Phương pháp giám định

- Người giám định/cơ quan giám định

- Kết quả giám định: Tên khoa học của\r\nloài

- Phiếu kết quả giám định chi tiết\r\ntham khảo phụ lục B.

Phụ\r\nlục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Bệnh đốm củ khoai tây

Tên khoa học: Polyscytalum pustulans\r\n(M.N. Owen & Wakef.) M.B. Ellis

Tên khác: Oospora pustulans\r\nM.N. Owen & Wakef.

Vị trí phân loại:

Ngành: Ascomycota

Giống: Polyscytalum

A.2  Phân bố

Trong nước: Chưa có mặt ở Việt Nam

Trên thế giới: Châu Á: Iran; Châu\r\nPhi: South Africa; Châu Mỹ: Canada, USA; Châu Âu: Estonia,\r\nGermany, Ireland, Lithuania, Norway, Romania, Russian Federation, UK; Châu Đại\r\nDương: Australia, New Zealand.

A.3  Ký chủ

Solanum tuberosum\r\n(khoai tây), Solanum (chi cà)

A.4  Đặc điểm sinh học

Các củ bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh\r\nquan trọng trong lô củ giống hoặc trong kho chứa. Nấm lây lan và sản sinh bào tử\r\nở phần gốc thân trước, sau đó là rễ củ, các rễ gần củ cái và sau đó lan rộng\r\nra. Các củ nhiễm bệnh thường nhiễm bệnh ở chồi hoặc mắt củ hơn là ở trên vỏ củ.\r\nBệnh phát triển dễ dàng ở các mô bị mất biểu bì. Củ gần củ cái nhất và phần gốc\r\nthân, thường nhiễm sớm hơn các phần ở xa. Khả năng xâm nhiễm tăng lên về cuối vụ.\r\nKhả năng xâm nhiễm của bệnh trên đất nặng tốt hơn đất nhẹ. Bệnh cũng có thể lây\r\nlan khi nhiệt độ mát và ẩm ướt khi thu hoạch. Các củ nhiễm bệnh thường không biểu\r\nhiện triệu chứng khi thu hoạch. Bệnh có thể xâm nhiễm sâu hơn vào củ, đặc biệt\r\nlà phần mắt củ ở trong kho bảo quản trong điều kiện ẩm. Nấm có thể tồn tại hơn\r\n6 tháng trong đất khô trong kho chứa và có thể phát tán vào không khí. Các củ\r\nkhỏe có thể bị xâm nhiễm bởi những bào tử này.

Bệnh thường phát triển sau khi bảo quản\r\n1 đến 2 tháng mặc dù bệnh có thể biểu hiện triệu chứng trên các củ được thu hoạch\r\nmuộn. Nấm có thể tìm thấy trong đất 04 năm sau khi trồng khoai tây và vẫn có thể\r\ngây bệnh cho củ khỏe. Vi hạch có thể tìm thấy ở các đĩa môi trường cấy lâu ngày\r\nvà trên các mô bệnh ở phần gốc thân và các củ giống thối. Hạch nấm được hình\r\nthành từ các vòng sợi nấm và các tàn dư. Hạch vẫn có khả năng nảy mầm sau 7 năm\r\nchôn vùi trong đất và gây bệnh nghiêm trọng trên đồng ruộng.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

PHIẾU KẾT QUẢ\r\nGIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:                      \r\nKhối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

7. Người lấy mẫu:

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN\r\n12195-2-13:2020. Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 2-13: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với nấm Polyscytalum pustulans (M.N. Owen & Makef) M.B\r\nEllis

13. Kết quả giám định:

Tên tiếng Việt: Bệnh đốm củ khoai tây

Tên khoa học: Polyscytalum\r\npustulans (M.N. Owen & Wakef.) M.B. Ellis

Tên khác: Oospora pustulans\r\nM.N. Owen & Wakef. Vị trí phân loại:

Ngành: Ascomycota

Giống: Polyscytalum

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] CABI (2018), Crop Protection\r\nCompedium.

[2] Commonwealth Mycologycal Institute\r\n(1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.

[3] IPPC (2006), ISΜM 27 Diagnostic\r\nprotocols for regulated pests.

[4] Viện Bảo vệ thực vật (1997), Tập\r\n1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng,\r\nPhương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.

[5] Viện Nấm học quốc tế IMI (1994),Kỹ\r\nthuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng, Lớp tập huấn 08-15/12/1994, tại\r\nViện Bảo vệ thực vật, Hà Nội.

[6] https://gd.eppo.int/taxon/PLSCPU

[7] Diseases, Pests and Disorders of\r\nPotatoes: A Color Handbook, 2008, Stuart J. Wale, Harold\r\nWilliam Platt, Nigel D. Cattlin