Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8400-42
Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật\r\n- Quy trình chẩn
- TCVN 8400-1 : 2019, phần 1: Bệnh\r\nlở mồm long móng;
\r\n\r\n- TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh\r\ndo vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;
\r\n\r\n- TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh\r\ngiun xoắn;
\r\n\r\n- TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh\r\nNiu CátXơn;
\r\n\r\n- TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh\r\ntiên mao trùng;
\r\n\r\n- TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh\r\nxuất huyết thỏ;
\r\n\r\n- TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh\r\nđậu cừu và đậu dê;
\r\n\r\n- TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh
- TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh\r\nviêm gan vịt typ I;
\r\n\r\n- TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh\r\nlao bò;
\r\n\r\n- TCVN 8400-11 : 2019, phần 11: Bệnh\r\ndịch tả vịt;
\r\n\r\n- TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh\r\nbạch lỵ và thương hàn ở gà;
\r\n\r\n- TCVN 8400-13 : 2019, phần 13: Bệnh\r\nsảy thai truyền nhiễm do Brucella;
\r\n\r\n- TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh\r\ntụ huyết trùng ở trâu bò;
\r\n\r\n- TCVN 8400-15 : 2019, phần 15: Bệnh\r\nxoắn khuẩn do Leptospira;
\r\n\r\n- TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh\r\nphù ở lợn do vi khuẩn E.coli;
\r\n\r\n- TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh\r\ndo Staphylococcus aureus ở gà;
\r\n\r\n- TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh\r\nphù đầu gà (coryza);
\r\n\r\n- TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh\r\nphó thương hàn lợn;
\r\n\r\n- TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh\r\nđóng dấu lợn;
\r\n\r\n- TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội\r\nchứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);
\r\n\r\n- TCVN 8400-22 : 2014 phần 22: Bệnh\r\ngiả dại ở lợn;
\r\n\r\n- TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh\r\nung khí thán;
\r\n\r\n- TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh\r\nviêm phế quản truyền nhiễm;
\r\n\r\n- TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh\r\ncúm lợn;
\r\n\r\n- TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh\r\ncúm gia cầm H5N1;
\r\n\r\n- TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh\r\nsán lá gan;
\r\n\r\n- TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh\r\nviêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;
\r\n\r\n- TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh\r\nLympho leuko ở gà;
\r\n\r\n- TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh\r\nMarek ở gà;
\r\n\r\n- TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh\r\ntụ huyết trùng gia cầm;
\r\n\r\n- TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh\r\ngumboro ở gia cầm;
\r\n\r\n- TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh\r\nlê dạng trùng ở trâu bò;
\r\n\r\n- TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh\r\nbiên trùng ở
- TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh\r\nTheil
- TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội\r\nchứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;
\r\n\r\n- TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh\r\nviêm phổi địa phương ở lợn;
\r\n\r\n- TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh\r\ntiêu chảy ở lợn do Coronavirus;
\r\n\r\n- TCVN 8400-39 : 2016, phần 39: Bệnh\r\nviêm đường hô hấp mãn tính ở gà;
\r\n\r\n- TCVN 8400-40 : 2016, phần 40: Bệnh\r\nnhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer
- TCVN 8400-41 : 2019, phần 41: Bệnh\r\ndịch tả lợn Châu Phi.
\r\n\r\n- TCVN 8400-42 : 2019, phần 42: Bệnh\r\ndịch tả loài nhai lại nhỏ;
\r\n\r\n- TCVN 8400-43 : 2019, phần 43: Bệnh\r\nlưỡi xanh;
\r\n\r\n- TCVN 8400-44 : 2019, phần 44: Bệnh\r\nroi trùng Trichomonosis;
\r\n\r\n- TCVN 8400-45 : 2019, phần 45: Bệnh\r\ngạo lợn, bệnh gạo bò;
\r\n\r\n- TCVN 8400-46 : 2019, phần 46: Bệnh\r\ndại;
\r\n\r\n- TCVN 8400-47 : 2019, phần 47: Bệnh\r\ndịch tả lợn cổ điển;
\r\n\r\n\r\n\r\n
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này\r\ncó thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu\r\nchuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc\r\nsử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an\r\ntoàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn\r\nquy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn\r\nđoán bệnh dịch tả trên loài nhai lại nhỏ.
\r\n\r\n\r\n\r\nTCVN 8402:2010. Bệnh động vật - Quy\r\ntrình mổ khám.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật\r\nngữ và định nghĩa sau:
\r\n\r\n3.1
Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ (PPR)\r\nlà bệnh truyền nhiễm cấp tính hoặc á cấp tính gây ra bởi vi rút thuộc nhóm\r\nMorbillivirus, họ Paramyxovidiae. Bệnh xảy ra chủ
3.2
- CPE (Cytopathic effect):\r\nbiến đổi bệnh lý tế bào
\r\n\r\n- DMEM (Dulbecco’s Modified\r\nEagle Medium): môi trường DMEM dùng cho nuôi cấy tế bào
\r\n\r\n- CV1/SALM (Vero cell/\r\nsignalling lymphocyte activation molecule): tế bào thận
- FCS (Fetal calf serum):\r\nhuyết thanh thai bê
\r\n\r\n- cELISA (Competitive Enzyme\r\n-Linked Immunosorbent Assay): phản ứng miễn dịch liên kết enzyme cạnh tranh
\r\n\r\n- Realtime RT-PCR
- PBS (Phosphate buffered\r\nsaline): dung dịch muối đệm phốt phát.
\r\n\r\n- ARN (Acid ribonucleic):\r\naxit ribonucleic.
\r\n\r\n- Ct (Threshold cycle):\r\nchu kỳ ngưỡng.
\r\n\r\n- DPBS (Phosphate buffered\r\ngelatin saline): dung dịch muối đệm phốt phát-gelatin
\r\n\r\n4 Thuốc thử và vật\r\nliệu thử
\r\n\r\nChỉ sử dụng các thuốc thử có cấp độ\r\ntinh khiết phân tích,sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.3
4.3.1
4.3.2
4.4
4.4.1
4.4.2
4.4.3
4.4.4
4.4.5
4.4.6
4.4.7
4.4.8
Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường\r\ncủa phòng thử nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị, dụng cụ sau:
\r\n\r\n5.1
5.1.1
5.1.2
5.1.3
5.1.4
5.1.5
5.1.6
5.2
5.2.1
5.2.2
5.2.3
5.2.4
5.3
5.3.1
5.3.2
5.4
5.4.1
5.4.2
5.4.3
5.4.4
5.4.5
5.4.6
5.4.7
5.4.8
Ngoài ra còn có các loại pipet và đầu\r\ntyp, ống 15 ml, 50 ml, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình\r\nthực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.
\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n- Bệnh được cho là xảy ra chủ yếu trên\r\ndê và cừu, dê thường mẫn cảm hơn cừu và có xu hướng trầm trọng hơn. Bệnh cũng\r\nđược thông báo xuất hiện trên lạc đà. Trâu, bò có thể nhiễm vi rút, nhưng không\r\nbiểu hiện triệu chứng lâm sàng và không thấy có sự bài thải vi rút trên những động\r\nvật này.
\r\n\r\n- Động vật khỏe mắc bệnh do tiếp xúc với\r\nđộng vật bị bệnh. Vi rút thường xâm nhập qua đường hô hấp và tiêu hóa thông qua\r\ntiếp xúc, không khí, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi như máng ăn, xe chở\r\ngia súc bệnh có chứa mầm bệnh. Phân, nước tiểu, sữa và các sản phẩm sảy thai của\r\ngia súc bệnh chứa lượng lớn vi rút.
\r\n\r\n- Tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết tùy thuộc\r\nvào nhiều yếu tố như: độc lực của vi rút, loài động vật cảm thụ, tuổi, giống,\r\ntình trạng miễn dịch và điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng,
- Bệnh biến đổi theo mùa, các ổ dịch\r\nthường xảy ra nhiều hơn trong mùa mưa và lúc hanh khô. Hoạt động tập trung buôn\r\nbán động vật cũng làm
- Vi rút có thề tồn tại trong thời\r\ngian dài trong mô lạnh hoặc đông lạnh, nhưng dễ bị bất hoạt trong điều kiện môi\r\ntrường và các tác nhân vật lý, hóa học.
\r\n\r\n\r\n\r\n- Thời kỳ ủ bệnh thường từ 4-6 ngày,\r\nđôi khi kéo dài khoảng 3-10 ngày. Trong trường hợp cấp tính, con vật sốt cao\r\nlên tới 41 °C, kéo dài 3-5 ngày đi kèm với các biểu hiện: ủ rũ, kém ăn, giảm vận\r\nđộng, miệng khô, mắt mũi kết dử. Xoang miệng có những vết lờ loét, tăng tiết\r\nnước bọt, xuất hiện cả mảng fibrin trên lưỡi. Trong giai đoạn sau của bệnh, con\r\nvật bị viêm phổi, ho dữ dội và thở thể bụng, tiêu
- Bệnh tích trong xoang miệng tập\r\ntrung chủ yếu ở
- Có hiện tượng xuất huyết, hoại tử\r\nniêm mạc đường tiêu hóa, có thể kéo dài từ niêm mạc miệng đến van hồi manh\r\ntràng. Vùng xung huyết hoặc xuất huyết đặc trưng của bệnh có thể xuất hiện dọc\r\ntheo\r\ncác\r\nnếp gấp của phần ruột già (dải ngựa vằn).
\r\n\r\n- Phổi bị phù,viêm phổi kẽ và xuất huyết.\r\nCó hiện tượng tắc nghẽn thức ăn trong ruột. Mảng payer bị hoại tử, hạch lympho\r\nsưng to. Gan, lách có hiện tượng xuất huyết và hoại tử.
\r\n\r\n\r\n\r\n- Kiểm tra mô bệnh học thấy xuất hiện\r\ncác tế bào khổng lồ đa nhân và các thể vùi trong tế bào chất, các tế bào khổng\r\nlồ này xuất hiện nhiều nhất trong các tế bào biểu mô phổi, biểu mô phế quản, phế\r\nnang và biểu mô đại tràng.
\r\n\r\n- Tế bào gan bị thoái hóa, xuất hiện\r\nkhông bào và bạch cầu
- Bệnh lưỡi xanh: con vật sốt, chảy nước\r\nmắt, nước mũi, khó thở
- Bệnh lở mồm long móng: niêm mạc miệng,\r\nmôi, lưỡi, chân răng đỏ
- Bệnh đậu cừu, đậu dê: con vật sốt,\r\nmí mắt sưng, tiết đầy dịch trong mồm và mũi. Xuất hiện các
7 Chẩn đoán trong\r\nphòng thí nghiệm
\r\n\r\n7.1.1
7.1.2
7.1.3
7.1.4 Mẫu mô:
\r\n\r\n- Động vật mới chết, mổ khám theo TCVN\r\n8402 : 2010.
\r\n\r\n- Tiến hành lấy các mẫu mô trong quá\r\ntrình mổ khám, lấy khoảng 5 g đến 10 g hạch lâm ba, hạch phổi, hạch màng treo\r\nruột, lách, mô phổi và màng niêm mạc ruột tại phần hồi, manh tràng.
\r\n\r\n\r\n\r\nMẫu bệnh phẩm (7.1) phải bao
CHÚ THÍCH: Tất cả các mẫu phải\r\nđược dán nhãn, ghi kí mã hiệu và gửi kèm theo Phiếu gửi mẫu bệnh phẩm
7.3.1
7.3.1.1
- Mẫu bệnh phẩm (7.1.4) được cắt nhỏ rồi\r\nnghiền trong cối chày sứ vô trùng với dung dịch PBS (theo A.1, phụ lục A) để\r\nthu được huyễn dịch 10 % (01 g mẫu mô + 9 ml dung dịch PBS). Cho huyễn dịch vào\r\nống ly tâm 15 ml, đặt vào máy ly tâm (5.2.2), ly tâm
7.3.1.2
- Huyễn dịch bệnh phẩm sau khi xử lý\r\nđược thực hiện chiết tách ARN bằng các kít thương mại và bảo quản mẫu ARN
- Các mẫu bệnh phẩm được tách chiết\r\nARN bằng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất (tham khảo phụ lục B).
\r\n\r\n7.3.1.3
Phản ứng khuếch đại được thực hiện\r\ntrong máy nhân gen theo phương pháp realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu\r\ncủa PPRV sử dụng cặp mồi xuôi và mồi ngược (tham khảo mục C.1, phụ lục C).
\r\n\r\nChuẩn bị mồi như sau:
\r\n\r\n- Chuẩn bị mồi gốc: mồi gốc và mẫu dò\r\ngốc ở
- Chuẩn bị mồi sử dụng:
\r\n\r\n+ Mồi sử dụng được dùng
+ Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 6 µM:\r\nLấy 6 µl mẫu dò gốc pha với 94 µl nước (4.2.5).
\r\n\r\nTrộn cùng 1 thể tích mồi xuôi, mồi ngược\r\nvà mẫu dò sau khi pha thành
7.3.1.4
Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (7.3.1.3)\r\nvà bộ kit thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (master mix) và cài đặt chu trình\r\nnhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng\r\ncó thể tham khảo trong bảng C.2, phụ lục C.
\r\n\r\nSau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên\r\nliệu:
\r\n\r\n- Cho 20 µI hỗn hợp nguyên liệu vào ống\r\nPCR 0,2 ml.
\r\n\r\n- Cho 5 µ
- Cho 5 µl nước tinh khiết, không có\r\nnuclease (4.2.5) vào ống PCR- Mẫu đối chứng âm.
\r\n\r\n- Cho 5 µl ARN (7.3.1.2) của mẫu vừa\r\ntách chiết vào ống PCR.
\r\n\r\n- Ly tâm nhẹ cho hỗn hợp khong bám\r\ntrên thành ống
\r\n\r\n- Đặt ống PCR vào máy realtime PCR\r\n(5.2.1)
\r\n\r\n- Chu trình nhiệt chạy phản ứng (tham\r\nkhảo bảng C.3, phụ lục C).
\r\n\r\nCHÚ THÍCH:
\r\n\r\n1) Phản ứng realtime PCR phải bao gồm:\r\nmẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.
\r\n\r\n2) Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng\r\nrealtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp\r\nphản\r\nứng.
\r\n\r\n7.3.1.5
Phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng\r\ndương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct ≈ giá trị Ct đã biết (± 2 Ct),\r\nmẫu đối chứng âm không có Ct.
\r\n\r\nVới điều kiện phản ứng trên:
\r\n\r\n1) Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là\r\ndương tính,
\r\n\r\n2) Mẫu không có giá trị Ct là âm tính,
\r\n\r\n3) Mẫu có giá trị Ct ≤ 40 và > 35\r\nđược coi là nghi ngờ.
\r\n\r\nNhững mẫu nghi ngờ này cần được xét\r\nnghiệm lại lần 2 hoặc xét nghiệm bằng phương pháp khác có độ nhạy và độ chính\r\nxác cao hơn để khẳng định và đưa ra kết luận cuối cùng.
\r\n\r\n7.3.2
7.3.2.1
7.3.2.1.1
- Mẫu sau khi được trộn dều bằng máy lắc\r\ntrộn (5.1.4), ly tâm nhẹ cho dung dịch xuống hết dưới, không bám trên thành ống.\r\nDùng xy lanh vô trùng lấy 0.5 ml dịch nồi phía trên, gắn màng lọc 0.2 µl\r\n(5.4.5) vào xy lanh, đẩy mẫu qua máng lọc vào trong ống eppendorf vô trùng.
\r\n\r\n7.3.2.1.2
- Mẫu mô (7.1.4) được nghiền trong cối\r\nchày sử vô trùng, bổ sung dung dịch DMEM không có huyết thanh bê tạo thành hỗn\r\ndịch 10 %, ly tâm 5000 g trong 3 min. Lấy 0.5 ml dịch nổi và lọc qua màng lọc\r\n0.2 µl, đẩy mẫu qua màng lọc vào trong ống eppendorf vô trùng.
\r\n\r\n7.3.2.1.3
- Ly tâm mẫu máu chống đông ở tốc độ\r\n1.000 rpm trong 5 min, thu lấy tế bào bạch cầu ở lớp giữa hồng cầu và huyết\r\ntương. Rửa tế bào bạch cầu bằng dung dịch DMEM không
- Bổ sung thêm 1 ml dung dịch DMEM\r\nkhông có huyết thanh bê, có bổ sung kháng sinh, lấy 0.5 ml mẫu để nuôi cấy,\r\nphân lập vi rút.
\r\n\r\n7.3.2.2
Bước 1: chuẩn bị tế bào\r\nCV1/SLAM (4.4.1) trong chai nuôi tế bào 25 cm2
- Giải đông tế bào CV1/SLAM trong bể\r\nđiều nhiệt ở
- Chuyển hỗn hợp tế báo vào ống ly tâm\r\n15 ml vô trùng chứa sẵn 10 ml môi trường phát triển tế bào DMEM đã bổ sung 10 %\r\nFCS
\r\n\r\n- Trộn đều bằng pipet, cho vào ly tâm ở\r\ngia tốc 200 g trong 5 min ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ phần dịch nổi phía trên.
\r\n\r\n- Bổ sung 5 ml môi trường phát triển tế\r\nbào DMEM đã bổ sung 10 % FCS vào ống, trộn đều bằng pipet.
\r\n\r\n- Hút chuyển dung dịch này vào chai\r\nnuôi tế bào 25 cm2 và nuôi trong tủ ấm (5.4.2)
\r\n\r\nQuan sát sự phát triển của tế bào hàng\r\nngày dưới kính hiển vi đảo ngược (5.4.1). Sau từ 2 ngày đến 4 ngày sẽ thu được\r\nmột thảm tế bào
Bước 2: gây nhiễm huyễn dịch\r\nbệnh phẩm
\r\n\r\n- Hút 0.5 ml dung dịch mẫu đã được xử\r\nlý (7.3.2.1) vào chai tế bào 1 lớp 25 cm2 đã được chuẩn bị tại bước\r\n1.
\r\n\r\n- Ủ ở 37 °C trong 1h, cứ 15 min lắc\r\nnhẹ 1 lần.
\r\n\r\n- Bổ sung 5 ml môi trường nuôi tế bảo\r\nDMEM đã bổ sung 2 % kháng sinh, ủ 37 °C trong tủ ấm (5.4.2).
\r\n\r\n- Kiểm tra bệnh tích tế bào
- Từ ngày thứ 4
7.3.2.3
- Khi quan sát dưới kính hiển vi\r\n(5.4.1) thấy xuất hiện bệnh tích tế bào: tế bào tròn, to, bị vỡ, tạo thành những\r\ncụm nhân, và phân tách thành từng lớp thì tiến hành thu hoạch hết hỗn dịch\r\ntrong chai nuôi tế bào vào ống ly tâm 50 ml vô trùng, giữ trong
- Xác định vi rút bằng phương pháp\r\nrealtime RT-PCR (7.3.1).
\r\n\r\n+ Nếu kết quả realtime RT-PCR dương\r\ntính thì kết luận mẫu có vi rút PPR trong mẫu,
\r\n\r\n+ Nếu kết quả realtime RT-PCR âm tính,\r\ntiến hành phân lập lần 2.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Đối với những mẫu\r\nkhông quan sát thấy
Phản ứng huyết thanh học có ý nghĩa chấn\r\nđoán khi con vật mắc bệnh có triệu chứng, bệnh tích nghi ngờ dịch tả loài nhai\r\nlại nhỏ
7.4.1
Mẫu máu sau khi lấy (7.1.3) được chắt huyết\r\nthanh từ xy lanh sang ống nghiệm vô trùng. Thời gian kể từ lúc lấy máu đến lúc\r\nchắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.
7.4.2
7.4.2.1
- Chuẩn bị dung dịch tế bào CV1/SLAM\r\ncó chứa 6.105 tế bào/ml (theo phụ lục D).
\r\n\r\n- Cách xác định liều TCID50\r\ncủa vi rút PPR (theo phụ lục E), pha dung dịch vi rút thành các nồng độ 1000 TCID50/ml,\r\n100
- Pha loãng huyết thanh cần kiểm tra\r\ntheo tỷ lệ 1/5, sau đó tiếp tục pha loãng 1/2 với môi trường nuôi cấy tế bào. Cần\r\nđánh dấu vị trí dùng cho đối chứng dương, đối chứng âm và mẫu kiểm tra trên đĩa\r\nphản ứng, để tránh nhầm lẫn.
\r\n\r\n- Hút 100 ul dung dịch chứa vi rút PPR\r\ntại nồng độ 1000 TCID50/ml và 100 ul huyết thanh đã pha loãng vào\r\ncác giếng trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (5.4.4)
\r\n\r\n- Đối chứng dương: hút 100ul dịch vi\r\nrút tại các nồng độ 100 TCID50/ml, 10 TCID50/
- Đối chứng âm: hút 200 ul dung dịch\r\nnuôi cấy tế bào vào 6 giếng.
\r\n\r\n- Ủ đĩa ở 37°C trong 1 h.
\r\n\r\n- Thêm 50 ul dung dịch tế bào CV1/SLAM\r\nchứa 6.105 tế bào/ml vào mỗi giếng, vỗ nhẹ đĩa và đậy nắp.\r\nỦ
7.4.2.2
- Phản ứng được công nhận khi 100 %\r\ncác giếng đối chứng dương ở các nồng độ 100 TCID50/ml, 10 TCID50/ml\r\nđều có bệnh tích tế bào, 50 % các giếng ở nồng độ 1 TCID50/ml
- Khi quan sát mà không phát hiện thấy\r\nCPE trong các giếng, điều đó chứng tỏ trong huyết thanh có kháng thể PPR, kháng\r\nthể này đã trung hòa virút nên không có CPE. Ngược lại, nếu phát hiện thấy CPE, chứng\r\ntỏ trong huyết thanh kiểm tra không có kháng thể PPR, vi rút không bị trung hòa\r\nđã gây nên các tổn thương CPE.
\r\n\r\n- Hiệu giá kháng thể được xác định là\r\nđộ pha loãng cuối cùng mà ở đó xảy ra 50 % hiện tượng trung hòa vi rút. Mẫu có hiệu\r\ngiá > 1/10 được coi là dương tính.
\r\n\r\n7.4.3
Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện\r\nkháng thể PRRV có bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần\r\ntheo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất, các bước thực hiện có thể tham khảo trong\r\nphụ lục F.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Đối với những mẫu\r\nnghi ngờ, cần phải làm lại để khẳng định, nếu vẫn nghi ngờ
Động vật nghi mắc bệnh được coi là\r\ndương tính với bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ khi có các đặc điểm về
A.1
A.1.1
Natri hydrophosphat (Na2HP
Kali dihydrophosphat (KH2P
Nước cất 900 ml
\r\n\r\nA.1.2
Hòa tan natri hydrophosphat và kali\r\ndihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng
Chú thích: Có thể sử dụng PBS thương mại\r\nvà
A.2
| \r\n A.2.1 | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Penicillin \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Streptomycin \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Kanamycin \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Nước cất \r\n | \r\n \r\n | \r\n
A.2.2
Lắc đều cho tan, lọc vô trùng bằng\r\nmàng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.4.6). Sử dụng tốt nhất trong 1 tuần, bảo\r\nquản ở
A.3
- Hòa tan 9,55 g bột DPBS (4.4.8)\r\ntrong 1 lít nước cất 2 lần, hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min. sử dụng tốt nhất trong\r\n2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.
\r\n\r\nA.4
A.4.1
| \r\n Môi trường DMEM \r\n | \r\n \r\n 500 ml \r\n | \r\n
| \r\n Huyết thanh thai bê (FCS), 10 % \r\n | \r\n \r\n 50 ml \r\n | \r\n
| \r\n Kháng sinh (Penicillin/streptomycin:\r\n 10000 Ul/ml) \r\n | \r\n \r\n 5 ml \r\n | \r\n
| \r\n Kháng nấm (Fungizone 250 µg/ml) \r\n | \r\n \r\n 5 ml \r\n | \r\n
A.4.2
Bổ sung thành phần kháng sinh và kháng\r\nnấm\r\nvào\r\nmôi trường
A.5
| \r\n A.5.1 | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n TPCK trypsin 10X \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n PBS (xem A.1) \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n A.5.2 | \r\n \r\n | \r\n
Lắc đều TPCK trypsin trong PBS, sau đó\r\nlọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.12), sau đó chia nhỏ lượng ra ống\r\nvà bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C. Sử dụng tốt nhất trong 6 tháng.
\r\n\r\nA.6
A.6.1
Chai nuôi tế bào 25 cm2 đã\r\nphát triển thành 1 lớp đạt 90 % bề mặt chai
\r\n\r\nMôi trường nuôi tế bào (xem A.3, phụ lục\r\nA)
\r\n\r\nTrypsin có 0,05 % EDTA
\r\n\r\nPBS ~ pH 7,4 (xem A.1, phụ lục A)
\r\n\r\nChú ý: tất cả các môi trường phải được\r\ncân bằng ở 37 °C và các vật tư dùng cho nuôi cấy tế bào đều phải đảm bào vô\r\ntrùng trước khi sử dụng.
\r\n\r\nA.6.2
- Hút bỏ môi trường trong chai tế bào\r\n25 cm2 đang nuôi tế bào CV1/SLAM 1 lớp 80 % bề mặt chai.
\r\n\r\n- Rửa bề mặt thảm tế bào bằng 5 ml\r\nDPBS 1X, tráng qua và hút bỏ DPBS.
\r\n\r\n-Thêm 5 ml trypsin 1X EDTA vào chai tế\r\nbào
Chú ý: Không để tế bào trong trypsin\r\nquá 15 min.
\r\n\r\nKhi tế bào đã tách hết, bổ sung 5 ml\r\nDMEM có 10 % FBS vào chai để vô hoạt trypsin, trộn đều, chuyển toàn bộ huyễn dịch\r\ntế bào sang ống ly tâm 15 ml.
\r\n\r\n- Ly tâm huyễn dịch tế bào ở gia tốc\r\n200 g trong 5 min. Loại bỏ phần dung dịch ở trên, giữ cặn tế bào.
\r\n\r\n- Hoàn nguyên cặn với 10 ml DMEM bổ\r\nsung 10 % FBS, chuyển vào chai nuôi cấy 25 cm2
\r\n\r\nNuôi chai tế bào trong tủ ấm 37 °C có\r\n5 % CO2
Theo dõi sự phát triển hàng ngày của tế\r\nbào trên kính hiển vi soi ngược. Sau 3 ngày lại thay môi trường nuôi cấy. Đến\r\nkhi tế bào phát triển thành một lớp bao phủ 90 % dĩa nuôi cấy thì lại tiến\r\nthành cấy chuyển lặp lại như quy trình trên đây.
\r\n\r\nCẢNH BÁO: Việc tách chiết RNA có sử dụng\r\nhóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy,\r\nnên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải
Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết\r\ntách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Nếu sử dụng kít chiết tách Qiagen\r\nRNeasy minikit
B.1
Chuẩn bị dung dịch RLT (600 µl/mẫu)\r\nvào ống ly tâm 50 ml vô trùng. Thêm 1/100 β-mercaptoetanol (β-ME) vào dung dịch\r\nRLT (sau khi bổ sung β-ME, dung dịch RLT này có thể giữ được 1 tháng\r\nở nhiệt độ phòng).
\r\n\r\nB.2
- Cho 200 µl huyễn dịch đã xử lý\r\n(7.3.1.1) vào ống eppendorf loại 1,5 ml, thêm 600 µl RLT (xem B.1), lắc đều\r\ntrên máy lắc trộn (5.1.4 ) rồi ly tâm nhẹ (5.1.7).
\r\n\r\n- Thêm 500 µ
- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc\r\nRNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc ≥ 8.000 g
- Bổ sung 700 µl dung dịch rửa 1 (RW1\r\nbuffer) vảo cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8.000 g, thay ống\r\nthu mới vào cột lọc.
\r\n\r\n- Cho 500 µl dung dịch rửa RPE buffer\r\nvào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8.000 g, thay ống thu mới, lặp\r\nlại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.
\r\n\r\n- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống\r\nthu trong 2 min ở
- Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 µI\r\nnước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách\r\nARN bằng cách ly tâm cột lọc trong 1 min ở gia tốc ≥ 8000 g, bỏ cột lọc, giữ lại\r\ndung dịch trong ống thu ARN.
\r\n\r\n- Bảo quản mẫu ARN thu được
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu dò \r\n | \r\n \r\n PPR-P \r\n | \r\n \r\n FAM-CGGCTGAGGCACTCTTCAGGCTGC-BHQ1 \r\n | \r\n
| \r\n Mồi xuôi \r\n | \r\n \r\n PPR-F \r\n | \r\n \r\n GAGTCTAGTCAAAACCCTCGTGAG \r\n | \r\n
| \r\n Mồi ngược \r\n | \r\n \r\n PPR-R \r\n | \r\n \r\n TCTCCCTCCTCCTGGTCCTC \r\n | \r\n
GHI CHÚ:
\r\n\r\nTrình tự cặp mồi và mẫu dò trong Bảng\r\nC.1 được được Tổ chức Thú y thế giới (OIE) khuyến cáo sử dụng. Các phòng thí\r\nnghiệm có thể sử dụng cặp mồi và mẫu do khác theo khuyến cáo của phòng thí nghiệm\r\ntham chiếu của OIE hoặc khi OIE cập nhật trình tự cặp mồi và mẫu dò mới.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Nước tinh khiết không có nuclease \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 2X Reaction buffer \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi xuôi (20µM) \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi ngược (20µM) \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Probe (6µM) \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu RNA \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tổng thể tích \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
D.1
- Làm sạch buồng đếm và nắp kính.
\r\n\r\n- Nhẹ nhàng khuấy chai nuôi tế bào để\r\ntrộn đều đồng nhất.
\r\n\r\n- Hút 200 ul dung dịch tế bào vào ống\r\neppendorf mới, bổ sung 200 ul trypan blue 0.4 %, trộn đều.
\r\n\r\n- Hút 100 ul dung dịch tế bào và\r\ntrypan blue vào buồng đếm, nhỏ dung dịch vào cạnh buồng đếm dung dịch
- Đếm các tế bào còn sống (là các tế\r\nbào không bị nhuộm màu trypan blue) tại 4 hình vuông
D.2
Trong đó:
\r\n\r\nCt: số lượng tế bào ban đầu có trong 1\r\nml
\r\n\r\nT: tổng số tế bào tại 4 góc vuông
\r\n\r\nTb: hệ số pha loãng giữa dung dịch tế\r\nbào với trypan blue
\r\n\r\n1/4: hệ số góc vuông
\r\n\r\n104: hệ số chuyển đổi
\r\n\r\nVí dụ: Đếm tổng số tế bào tại 4 góc\r\nvuông có 480 tế bào, Ct = 480 x 2 x
Công thức tính liều gây nhiễm 50 % tế\r\nbào thí nghiệm (TCID50) của Reed-Muench:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\n| \r\n A \r\n | \r\n \r\n là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm vi rút\r\n sát trên 50 %, tính bằng phần trăm (%). \r\n | \r\n
| \r\n B \r\n | \r\n \r\n là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm vi rút\r\n sát dưới 50 %, tính bằng phần trăm (%). \r\n | \r\n
| \r\n a \r\n | \r\n \r\n là nồng độ pha loãng vi rút tại A (lấy\r\n giá trị số mũ). \r\n | \r\n
| \r\n b \r\n | \r\n \r\n là nồng độ pha loãng vi rút tại B (lấy\r\n giá trị số mũ). \r\n | \r\n
VÍ DỤ:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n CHÚ THÍCH: (a) số giếng nhiễm vi rút/số\r\n giếng gây nhiễm với lượng nhiễm là 100 µl/giếng. Mũi tên chỉ hướng tăng lên của\r\n số nhiễm và số không nhiễm. \r\n | \r\n |||||||
Trong 100 µl dung dịch pha loãng vi\r\nrút nhiễm vào mỗi giếng có:
\r\n\r\n![](\"00918661_files/image002.jpg\")
Vậy TCID
Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện\r\nkháng thể PRRV có bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần\r\ntheo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.Có thể sử dụng ID Screen PPR Competition\r\nkit - Code 4P
F.1
- Nguyên liệu trong bộ kít (4.3.1) để ở\r\nnhiệt độ phòng 30 min trước khi làm phản ứng.
\r\n\r\n- Pha loãng dung dịch rửa 1X: 10 ml\r\ndung dịch nước rửa đặc 10X với 90 ml nước cất khử ion (4.3.2). Tính thể tích\r\ndung dịch nước rửa cần pha: 300 µl/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa
F.2
1 Nhỏ 25 µl Dilution Buffer 13\r\nvào các giếng;
\r\n\r\nNhỏ 25 µl Positive Control vào\r\nhai giếng A1 và
Nhỏ 25 µl Negative Control vào hai giếng\r\nC1 và D1
\r\n\r\nNhỏ 25 µl huyết thanh cần kiểm tra\r\n(7.4.1) vào các giếng còn lại.
\r\n\r\n2. Ủ dĩa thí nghiệm ở nhiệt độ 37 °C ± 3 °C trong\r\n45 min
\r\n\r\n3. Đổ bỏ dung dịch trong đĩa; rửa đĩa\r\nbằng cách thêm 300 µl dung dịch rửa 1X vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ\r\n3 lần, tránh làm khô đĩa giữa các lần rửa.
\r\n\r\n4. Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha\r\nloãng Conjuate 10X 1/10 với Dilution Buffer 4
\r\n\r\n5. Nhỏ 100 µl dung dịch Conjugate 1X\r\nvào các giếng;
\r\n\r\n6. Ủ đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ 21 °C ± 5 °C trong\r\n30 min ± 3 min
\r\n\r\n7. Đổ bỏ dung dịch trong đĩa; rửa đĩa\r\nbằng cách thêm 300 µl dung dịch rửa 1X vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Rửa lặp lại\r\n3 lần, tránh làm khô đĩa giữa các lần rửa
\r\n\r\n8. Nhỏ 100 µl dung dịch Subtrate\r\nSolution vào các giếng;
\r\n\r\n9. Ủ đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ 21 °C ± 5 °C trong\r\n15 min ± 2 min trong phòng tối
\r\n\r\n10. Nhỏ 100 µl dung dịch stop Solution\r\n(dừng phản ứng) vào các giếng để dừng phản ứng
\r\n\r\n11. Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng\r\nmáy đọc ELISA (5.3.1) ở
F.3
Điều kiện phản ứng được công nhận khi:
\r\n\r\n- Mật độ quang học (OD) của đối chứng\r\nâm (ODNC) > 0,7.
\r\n\r\n- Mật độ quang học của đối chứng dương\r\n(ODPC)/OD của đối chứng âm (ODNC) <0,3.
\r\n\r\nĐánh giá kết
+ Mẫu dương tính khi: S/N% ≤ 50%.
\r\n\r\n+ Mẫu âm tính khi: S/N % > 60%
\r\n\r\n+ Mẫu có 50% < S/N % ≤ 60% được cho là\r\nnghi ngờ.
\r\n\r\n[1] Adombi, C. M., Lelenta, M.,\r\nLamien, C. E., Shamaki, D., Koffi, Y. M., Traore, A., & Luckins, A. G.\r\n(2011). Monkey CV1 cell line expressing the sheep-goat SLAM protein: a highly\r\nsensitive cell line for the isolation of peste des petits ruminants virus from\r\npathological specimens. Journal of Virological Methods, 173(2), 306-313.
\r\n\r\n[2] Aktas et al, 2011. Peste des\r\npetits ruminants in suckling lambs case report Israel journal of veterinary\r\nmedicine, Vol 66(1).
\r\n\r\n[3] Ammerman Nicole et al, 2008.\r\nGrowth and Maintenance of Vero Cell Lines. Curr Protoc Microbiol.
\r\n\r\n[4] Naveen Kumar et al, 2014. Peste\r\nDes Petits Ruminants Virus Infection of Small Ruminants: A Comprehensive\r\nReview. Viruses 2014, 6, 2287-2327.
\r\n\r\n[5] OIE, 2013. Manual of Diagnostic\r\nTests and Vaccines for Terrestrial Animals, Chapter 2.7.10: Peste des petits\r\nruminants (Infection with peste des petits ruminants virus).
\r\n\r\n[6] Olivier Kwiateka et al, 2010.\r\nQuantitative one-step real-time RT-PCR for the fast detection of the four\r\ngenotypes of PPRV. Journal of Virological Methods 165, 168-177.
\r\n\r\n\r\n\r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
File gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-42:2019 về Bệnh động vật – Quy trình chuẩn đoán – Phần 42: Bệnh dịch tả loại nhai lại nhỏ đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-42:2019 về Bệnh động vật – Quy trình chuẩn đoán – Phần 42: Bệnh dịch tả loại nhai lại nhỏ
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8400-42:2019 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2019-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |