QUY\r\nTRÌNH GIÁM ĐỊNH TUYẾN TRÙNG GÂY BỆNH THỰC VẬT
\r\nPHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG
Procedure for\r\nidentification of plant parasitic nematodes
\r\nPart\r\n1: General requirements
TCVN 12194-1:2019 do cục Bảo vệ thực\r\nvật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường\r\nChất\r\nlượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\nBộ TCVN 12194 Quy trình giám định\r\ntuyến trùng gây bệnh thực vật gồm các phần sau đây:
\r\n\r\n- TCVN 12194-1:2019, Phần 1: Yêu cầu\r\nchung
\r\n\r\n- TCVN 12194-2-1:2018, Phần 2-1: Yêu\r\ncầu cụ thể đối với tuyến trùng Nacobbus aberrans (Thorne) Thorne & Allen
\r\n\r\n- TCVN 12194-2-2:2018, Phần 2-2: Yêu\r\ncầu cụ thể đối với tuyến trùng Aphelenchoides ritzemabosi (Schwartz) Steiner\r\n& Buhrer
\r\n\r\n- TCVN 12194-2-3:2018, Phần 2-3: Yêu\r\ncầu cụ thể đối với tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev
\r\n\r\n\r\n\r\n
QUY TRÌNH\r\nGIÁM ĐỊNH TUYẾN TRÙNG GÂY BỆNH THỰC VẬT
\r\nPHẦN\r\n1: YÊU CẦU CHUNG
Procedure for\r\nidentification of plant parasitic nematodes
\r\nPart\r\n1: General requirements
Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu chung\r\nđối với quy trình giám định tuyến trùng gây bệnh thực vật
\r\n\r\n\r\n\r\nTài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết\r\ncho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì\r\náp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các phiên bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).
\r\n\r\nTCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật\r\n- Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này, sử dụng các thuật\r\nngữ và định nghĩa sau đây:
\r\n\r\n3.1
\r\n\r\nTuyến trùng ký sinh thực vật (plant\r\nparasitic nematodes)
\r\n\r\nNhững loài tuyến trùng chủ yếu sống\r\ntrong đất và có quan hệ chặt\r\nchẽ với thực vật đang phát triển và trong các tàn dư, sản phẩm thực vật sau thu\r\nhoạch. Chúng có thể sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật bao gồm rễ, củ, thân, lá,\r\nhoa, quả và hạt của các thực vật đang phát triển theo từng nhóm trùng\r\nký sinh.
\r\n\r\n3.2
\r\n\r\nTuyến trùng nốt sần rễ (root-knot\r\nnematodes)
\r\n\r\nTuyến trùng ký sinh thực vật thuộc giống\r\nMeloidogyne. Tuyến trùng tuổi 2 xâm nhiễm vào trong rễ củ,... của cây ký\r\nchủ, tìm vị trí thích hợp và kích thích sự phát triển của các tế bào, tạo thành\r\ncác tế bào khổng lồ,\r\nhình thành các nốt sưng phồng trên rễ, củ,., của cây ký chủ. Con cái\r\nphình to hình cầu, quả lê, mầu trắng hoặc trắng kem, nằm trong các nốt sần trên\r\nrễ cây ký chủ. Con cái đẻ trứng thành bọc dính kết bên ngoài cơ thể.
\r\n\r\n3.3
\r\n\r\nTuyến trùng bào nang (cyst\r\nnematodes)
\r\n\r\nTuyến trùng ký sinh thực vật thuộc họ\r\nHeteroderidea. Tất cả các giai đoạn sinh trưởng của tuyến trùng bào nang đều gây hại\r\ncho cây ký chủ. Con cái màu trắng hoặc màu kem phình to dần, thành hình cầu, quả\r\nchanh, quả lê, phá vỡ lớp vỏ rễ nhô phần cơ thể ra bên ngoài. Con cái trưởng thành sau\r\nkhi thụ tinh, cơ thể chứa đầy trứng và lớp vỏ bên ngoài khô dần, biến màu chuyển\r\nthành bào nang khi chết. Trứng nằm trong bào nang được bảo vệ chống lại những điều\r\nkiện bất lợi của môi trường trong thời gian dài.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ thông\r\nthường của phòng thí nghiệm và các thiết bị sau:
\r\n\r\n4.1 Kính lúp soi\r\nnổi\r\ncó độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần.
\r\n\r\n4.2 Kính hiển vi có thước đo,\r\ncó độ phóng đại\r\ntừ 40 lần đến 1 000 lần.
\r\n\r\n4.3 Máy ly tâm có thể vận\r\nhành từ 1 200 vòng/phút đến 3 000 vòng/phút.
\r\n\r\n4.4 Máy khuấy từ\r\ngia nhiệt có\r\nthể vận hành từ 50 vòng/phút đến 1 700 vòng/phút.
\r\n\r\n4.5 Tủ định ôn có thể duy\r\ntrì ở nhiệt độ từ\r\nâm 4 °C đến 50 °C.
\r\n\r\n4.6 Bình hút ẩm
\r\n\r\n4.7 Tủ ấm có thể duy\r\ntrì ở nhiệt độ từ 5 °C đến 70 °C
\r\n\r\n4.8 Tủ lạnh có thể duy\r\ntrì ở nhiệt độ 5 °C ± 5 °C
\r\n\r\n4.9 Bộ rây lọc\r\ntuyến trùng\r\ncó đường kính mắt rây là: 5 μm, 25 μm, 40 μm, 63 μm, 75 μm, 150 μm, 250 μm, 700 μm,\r\n1 000 μm, 1 200 μm, lưới lọc có đường kính mắt lưới 2 mm.
\r\n\r\n4.10 Dụng cụ thủy\r\ntinh:\r\ncốc thủy tinh thể\r\ntích 1 000 ml, 500 ml, 250 ml, 100 ml; chậu thủy tinh có dung tích 4 lít, chén\r\nthủy tinh 4 ml, đũa thủy tinh, đĩa petri, đĩa đồng hồ, pipet.
\r\n\r\n4.11 Kim gắp tuyến\r\ntrùng
\r\n\r\n4.12 Lam
\r\n\r\n4.13 Lamen
\r\n\r\n4.14 Khay men
\r\n\r\n4.15 Kim dầm mẫu
\r\n\r\n4.16 Giấy lọc các\r\nloại
\r\n\r\n4.17 Túi ni-lông đựng\r\nmẫu
\r\n\r\n4.18 Máy xay mẫu
\r\n\r\n4.19 Dao mổ (lưỡi dao số\r\n11)
\r\n\r\n4.20 Kính lúp cầm\r\ntay
\r\n\r\n\r\n\r\nChỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết\r\nphân tích, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n5.1 Kẽm sunphat\r\n(ZnSO4) hoặc Magiê\r\nsunphat (MgSO4) hoặc đường\r\nSaccaroza (C12H22O11) (d=1,18 (g/ml))
\r\n\r\n5.2 Formaldehyde\r\n(CH2O) 40 %
\r\n\r\n5.3 Glycerol (C3H8O3)
\r\n\r\n5.4 Triethanolamine\r\n(C6H15NO3)
\r\n\r\n5.5 Cồn (C2H5OH)\r\n96 %
\r\n\r\n5.6 Nước cất (H2O): nước cất một\r\nlần
\r\n\r\n5.7 Parafin (CnH2n+2)\r\nhoặc sáp ong
\r\n\r\n5.8 Cao lanh (AI2O3.2SiO2.2H2O)
\r\n\r\n5.9 Keo dính tiêu\r\nbản
\r\n\r\n5.10 Canxi oxit\r\n(CaO)
\r\n\r\n5.11 A xít Lactic\r\n(C3H6O3) 40 %
\r\n\r\n5.12 Natri\r\nhydroxit (NaOH) hoặc Kali hydroxit (KOH)
\r\n\r\n5.13 Clorua natri\r\n(NaCl)
\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n6.1.1 Đối với hàng\r\nhóa xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước
\r\n\r\nLấy mẫu theo TCVN 8597:2010.
\r\n\r\n6.1.2 Đối với cây\r\ntrồng ngoài đồng ruộng
\r\n\r\n6.1.2.1 Lấy mẫu đất
\r\n\r\n- Đối với rau, màu, cây trồng ngắn\r\nngày, cây công nghiệp dài ngày và cây ăn quả giai đoạn vườn ươm:
\r\n\r\nĐiều tra ngẫu nhiên hoặc theo 5 điểm\r\nchéo góc. Tại mỗi điểm, tiến hành điều tra thu mẫu từ 3 cây đến 5 cây. Lấy mẫu\r\nđất tại các điểm điều tra ở độ sâu từ 5 cm đến 20 cm xung quanh vùng rễ cây bị bệnh.\r\nSố mẫu lấy quy định như sau:
\r\n\r\n< 100 m2 lấy từ 4 mẫu đến\r\n5 mẫu
\r\n\r\n100 m2 đến < 500 m2\r\nlấy từ 10 mẫu đến 12 mẫu
\r\n\r\n500 m2 đến < 1 000 m2\r\nlấy từ 20 mẫu đến 25 mẫu
\r\n\r\n1 000 m2 đến < 10 000 m2\r\nlấy từ 26 mẫu đến 40 mẫu
\r\n\r\nDiện tích > 1 ha lấy từ 45 mẫu đến\r\n50 mẫu, sau đó mẫu ở từng khu vực có thể trộn với nhau dồn lại còn 25 mẫu.
\r\n\r\n- Đối với cây công nghiệp dài ngày và\r\ncây ăn quả:
\r\n\r\nMỗi cây lấy mẫu tại 3 điểm trong vùng\r\nrễ cây và theo góc của tam giác đều mà gốc cây là trung tâm, chiều sâu lấy mẫu\r\nđất theo chiều sâu của rễ. Mẫu đất lấy khối lượng 500 g/mẫu.
\r\n\r\nSố lượng cây điều tra phụ thuộc vào mật\r\nđộ cây trồng tại mỗi vùng điều tra, quy định như sau:
\r\n\r\n< 15 cây: điều tra hết số cây
\r\n\r\n15 đến 100 cây: điều tra từ 15 cây đến\r\n25 cây (theo điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra từ 3 cây đến 5 cây)
\r\n\r\n101 đến 500 cây: điều tra từ 25 cây đến\r\n50 cây (theo điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra từ 5 cây đến 10 cây)
\r\n\r\n> 500 cây, số lượng mẫu tùy theo mật\r\nđộ cây trồng tại mỗi vùng điều tra. Nếu số mẫu vượt quá 25 mẫu thì dùng phương\r\npháp trộn để 1ha có số lượng từ\r\n20 mẫu đến 25 mẫu.
\r\n\r\n6.1.2.2 Lấy mẫu cây
\r\n\r\nChọn điểm điều tra tương tự phần thu\r\nthập mẫu đất (6.1.2.1).
\r\n\r\nBộ phận cây trên mặt đất cắt thành từng\r\nđoạn từ 20 cm đến 25 cm, cho vào túi ni-lông (4.17).
\r\n\r\nBộ phận cây dưới mặt đất (rễ) cắt\r\nthành từng đoạn từ 10 cm đến 20 cm; củ, thân củ, thân ngầm, thu các vết biến mầu,\r\nbiến dạng, nốt sần cho vào túi ni-lông.
\r\n\r\n\r\n\r\nMẫu giám định và mẫu lưu sau giám định được bảo\r\nquản như sau:
\r\n\r\nCác bộ phận tươi có triệu chứng nghi\r\nlà bị tuyến trùng gây hại\r\n(thân, lá, hoa, hạt, rễ, củ, thân củ, thân ngầm) được để trong các túi ni-lông\r\n(4.17) có lỗ thông\r\nkhí, có đính nhãn và\r\nbảo quản trong tủ lạnh (4.8) ở nhiệt độ khoảng 5 °C.
\r\n\r\nMẫu đất được bảo quản bằng cách cho vào túi\r\nni-lông có lỗ thông\r\nkhí, có đính nhãn và để ở những nơi thoáng\r\nmát ở nhiệt độ phòng hoặc tốt nhất trong tủ mát nhiệt độ từ 12 °C đến 15 °C.
\r\n\r\nDung dịch có tuyến trùng được tách ra\r\ntừ bộ phận bị hại thường được định hình trong dung dịch bảo quản tuyến trùng\r\n(xem 7.2.2.3) để trong các lọ kín có dán nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt\r\nđộ từ 5 °C đến 10 °C.
\r\n\r\nTiêu bản lam phải có nhãn ký hiệu mẫu,\r\nđể trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và được bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n7 Phát hiện và thu\r\ntuyến trùng
\r\n\r\n\r\n\r\n7.1.1 Ký chủ
\r\n\r\nMỗi loài tuyến trùng ký sinh thực vật\r\nđều có phổ ký chủ khác nhau. Việc phát hiện các loài tuyến trùng phải dựa vào\r\ndanh mục ký chủ của từng loài cụ thể.
\r\n\r\n7.1.2 Triệu chứng\r\nhại
\r\n\r\nTriệu chứng hại của các loài tuyến trùng\r\nkhác nhau tùy thuộc vào đặc tính sinh học của từng loài.
\r\n\r\n\r\n\r\n7.2.1 Tách lọc\r\ntuyến trùng bào nang
\r\n\r\n7.2.1.1 Tách tuyến\r\ntrùng bào nang từ các bộ phận của cây
\r\n\r\nRửa các bộ phận của cây (rễ, củ, thân\r\ncủ) dưới vòi nước thu phần nước rửa và lọc qua rây có đường kính mắt rây từ\r\n0,05 mm đến 0,1 mm. Hong khô rây và đưa lên kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ\r\n10 lần đến 40 lần (4.1) để quan sát và đếm bào nang.
\r\n\r\nCắt rễ, củ đã rửa, ngâm trong đĩa\r\npetri (4.10) có chứa nước. Sau 2 giờ đến 4 giờ, đưa đĩa petri lên kính lúp soi\r\nnổi có độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần (4.1) để quan sát tuyến trùng bào\r\nnang.
\r\n\r\n7.2.1.2 Tách lọc tuyến\r\ntrùng bào nang từ đất
\r\n\r\n7.2.1.2.1 Phương pháp\r\ndùng giấy lọc Burh
\r\n\r\nKhối lượng mẫu đất từ 5 gam đến 10\r\ngam.
\r\n\r\nCho đất vào cốc thủy tinh (4.10) chứa\r\n0,5 lít nước, cho thêm vào từ 3 giọt đến 5 giọt dung dịch kiềm bão hoà (NaOH hoặc\r\nKOH) (5.12), khuấy đều. Đổ hỗn hợp dịch qua rây (4.9) có đường kính mắt rây 2\r\nmm để lọc đá, rác.
\r\n\r\nLấy giấy lọc (4.16) cuốn xung quanh mặt\r\ntrong của cốc thủy tinh sao cho 2 mép giấy chồng lên nhau 1cm, đổ dịch lọc vào,\r\nkhuấy đều theo một chiều trong 3 phút sau đó dừng lại cho bào nang bám vào mép\r\ntrên giấy lọc.
\r\n\r\nNhấc nhẹ giấy lọc ra, quan sát trực tiếp\r\nbằng kính lúp cầm tay có độ phóng đại\r\n10 lần, để phát hiện những bào nang nổi dính bám vào phần đường thẳng của vòng\r\ngiấy tiếp giáp giữa giấy lọc với mặt nước. Hoặc rửa giấy lọc vào một cốc nước sạch,\r\nđổ nước đó lên rây có đường kính mắt rây từ 0,05 mm đến 0,1 mm, quan sát bằng\r\nkính lúp cầm tay (4.20) có độ phóng đại 10 lần.
\r\n\r\n7.2.1.2.2 Phương pháp\r\ndùng dung dịch NaCL
\r\n\r\nKhối lượng mẫu đất từ 10 gam đến 100\r\ngam.
\r\n\r\nPha dung dịch NaCI ở nồng độ 20 % (xem\r\nA.3). Cho đất vào dung dịch NaCI trên, khuấy đều cho bào nang nổi lên. Đổ hỗn hợp\r\ndịch nói trên qua rây có đường kính mắt rây 2 mm để lọc đá, rác. Đổ hỗn hợp dịch\r\ntrên qua rây có đường kính mắt rây từ 0,05 mm đến 0,1 mm để giữ lại bào nang.\r\nQuan sát bào nang thu được bằng kính lúp cầm tay (4.20) có độ phóng đại 10 lần
\r\n\r\n7.2.1.2.3 Phương pháp\r\ndùng bình lọc Fenwick\r\n(xem hình 1)
\r\n\r\nKhối lượng mẫu đất từ 100 gam đến 200\r\ngam.
\r\n\r\nĐổ đất vào rây (4.9) có đường kính mắt\r\nrây 2 mm, xối nước trực tiếp vào đất để đất tan vào bình cho đến khi lượng nước\r\ngần đầy bình, loại bỏ phần cặn trên rây. Mở vòi bình lọc với tốc độ chảy vừa phải\r\nsao cho các hạt đất tiếp tục chìm xuống còn bào nang nổi lên trên mặt nước và\r\ntràn qua miệng bình theo một máng dẫn xuống rây thu bào nang có đường kính mắt\r\nrây từ 0,05 mm đến 0,1 mm ở phía dưới.
\r\n\r\nHong khô rây ở nhiệt độ\r\nphòng, thu bào nang quan sát và đếm.
\r\n\r\n7.2.1.3 Bảo quản tuyến\r\ntrùng bào nang
\r\n\r\nBào nang thu được theo các phương pháp\r\ntrong điều 7.2.1, được hong khô ở nhiệt độ phòng, thu bào nang và đựng trong lọ\r\nthủy tinh có nắp đậy kín\r\nđể sử dụng làm tiêu bản lam.
\r\n\r\n\r\n\r\n
Hình 1 - Bình\r\nFenwick tách bào nang trong đất
\r\n\r\n7.2.2 Tách lọc\r\ntuyến trùng ký sinh thực vật
\r\n\r\n7.2.2.1 Tách lọc tuyến\r\ntrùng từ các bộ phận của cây
\r\n\r\n7.2.2.1.1 Kiểm tra trực\r\ntiếp
\r\n\r\nCác bộ phận của cây (thân, lá, hoa, hạt, củ,\r\nthân củ, rễ,...) được rửa sạch. Chọn các bộ phận của cây có vết biến\r\nmàu, biến dạng, nốt sần cắt nhỏ (khoảng 0,5 mm) đặt vào đĩa petri (4.10). Thêm\r\nnước vào đĩa để giữ cho mẫu không bị khô. Đặt đĩa petri có mẫu dưới kính lúp\r\nsoi nổi (4.1) có độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần. Dùng kim (4.15) dầm nhẹ mẫu\r\nvà quan sát tìm tuyến trùng.
\r\n\r\nNếu phát hiện thấy tuyến trùng hình\r\ngiun, dùng kim (4.11) gắp tuyến trùng lên lam kính (4.12) có giọt nước nhỏ, đậy\r\nnhẹ lamen (4.13) và quan sát dưới kính hiển vi (4.2) có độ phóng đại từ 40 lần\r\nđến 1 000 lần.
\r\n\r\nNếu phát hiện thấy tuyến trùng cái\r\nhình cầu, quả chanh hoặc quả lê, gắp sang chén thủy tinh có chứa dung dịch axít\r\nlactic 40 % (5.11) để chuẩn bị làm tiêu bản phần sau con cái.
\r\n\r\n7.2.2.1.2 Phương pháp lọc\r\ntĩnh
\r\n\r\nMẫu thực vật (thân, lá, hoa, hạt, củ,\r\nthân củ, rễ) được rửa sạch, cắt thành những đoạn thật nhỏ (khoảng 0,5 mm). Đặt\r\nmẫu đã cắt lên trên rây (4.9) có đường kính mắt rây 75 pm và thêm nước vừa xâm xấp rây.\r\nSau 24 giờ đến 48 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thủy tinh (4.10). Dùng pipet\r\n(4.10) hút lấy dung dịch thu được ở cốc thủy tinh cho vào đĩa đồng hồ\r\n(4.10) và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi (4.1) có độ phóng đại từ 10 lần đến 40\r\nlần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim (4.11) gắp tuyến trùng lên lam\r\nkính (4.12) có giọt nước nhỏ, đậy nhẹ lamen (4.13) và quan sát dưới kính hiển\r\nvi (4.2) có độ phóng đại từ 40 lần đến 1 000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi\r\nhết nước trong cốc thủy tinh.
\r\n\r\n7.2.2.1.3 Phương pháp ly tâm
\r\n\r\nMẫu thực vật (thân, lá, hoa, hạt, củ,\r\nthân củ, rễ..) được rửa sạch, cắt thành từng đoạn 0,5 cm, trộn đều và cân lấy từ\r\n5 gam đến 10 gam (tùy theo lượng mẫu có). Thêm 250 ml nước sạch, nghiền nhỏ mẫu\r\nbằng máy xay mẫu (4.18). Lọc qua rây (4.9) có đường kính mắt rây 1 200 μm, dùng\r\nvòi nước nhỏ rửa sạch từ phía trên xuống cho đến khi phần mẫu nghiền phía trên\r\nrây sạch. Thu phần nước phía dưới và thêm nước cho đủ 1 lít, khuấy đều.
\r\n\r\nLấy 100 ml dung dịch thu được ở trên cho vào\r\nống li tâm. Thêm 1 thìa cà phê bột cao lanh (5.8) vào ống và khuấy đều bằng máy\r\nkhuấy. Đặt ống nghiệm vào máy ly tâm (4.3) và ly tâm với vận tốc 1 800 vòng/phút\r\ntrong 4 phút. Sau đó, bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần cặn phía dưới.\r\nThêm dung dịch kẽm sunphat hoặc magiê sunphat hoặc đường saccaroza (5.1) (cao\r\nhơn ít nhất 1 cm so với bề mặt của lớp cặn) và khuấy đều trong 1 phút. Tiếp tục\r\nly tâm với vận tốc 1 800 vòng/phút trong 4 phút.
\r\n\r\nĐổ phần dung dịch phía trên của ống ly\r\ntâm qua rây lọc có đường kính mắt rây 5 pm (4.9). Rửa phần trên rây bằng nước sạch\r\nvà dùng bình xịt nước để rửa, thu tuyến trùng bám dính trên rây vào cốc thủy tinh\r\n(4.10) và tiến hành kiểm tra tuyến trùng.
\r\n\r\nDùng pipet (4.10) hút lấy dung dịch\r\nthu được ở cốc thủy tinh cho vào đĩa đồng hồ (4.10) và kiểm tra dưới kính lúp\r\nsoi nổi (4.1) có độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến\r\ntrùng, dùng kim (4.11) gắp tuyến trùng lên lam kính (4.12) có giọt nước nhỏ,\r\nđậy nhẹ lamen (4.13) và quan sát dưới kính hiển vi (4.2) có độ phóng đại từ 40\r\nlần đến 1 000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thủy tinh.
\r\n\r\n7.2.2.2 Tách lọc tuyến\r\ntrùng từ đất
\r\n\r\n7.2.2.2.1 Phương pháp\r\nrây Cobb
\r\n\r\nCân 100 gam đất cho vào chậu thủy tinh\r\n(4.10), cho thêm từ 2 lít đến 3 lít nước vào chậu thủy tinh và ngâm trong 1 giờ\r\nđến 2 giờ cho đất tan. Khuấy đều đất và nước, để lắng trong 10 giây. Sau đó lọc\r\nqua rây (4.9) có đường kính mắt rây 1 000 μm, rửa sạch rây và phần cặn trên\r\nrây. Dung dịch được thu vào chậu thủy tinh thứ 2. Bỏ phần cặn còn lại trên rây\r\nvà trong chậu thủy tinh ban đầu. Quá trình này lặp lại từ 2 đến 3 lần nhằm loại\r\nbỏ cát, sạn, rác và đá.
\r\n\r\nKhuấy đều dung dịch đã thu được ở trên\r\nvà tiếp tục lọc bằng rây có đường kính mắt rây 700 μm, dung dịch được thu vào\r\nchậu thủy tinh. Phần cặn trên rây được rửa sạch và cho vào cốc thủy tinh\r\n(4.10).
\r\n\r\nTiếp tục lọc dung dịch thu được ở chậu\r\nthủy tinh qua các rây có đường kính mắt rây 250 μm, 150 μm và 25 μm. Phần cặn\r\ntrên rây cũng được rửa sạch và cho vào cốc thủy tinh. Riêng với rây 25 μm có thể\r\nlọc lại từ 3 đến 4 lần.
\r\n\r\nNếu lượng nước thu được trong cốc thủy\r\ntinh quá đầy, để lắng trong 2 giờ và đổ bớt nước phía trên. Tiếp đó, chuyển dung dịch\r\ntrên sang rây lọc tĩnh. Sau 24 giờ đến 48 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc\r\nthủy tinh. Dùng pipet (4.10) hút lấy dung dịch thu được ở cốc thủy tinh cho vào\r\nđĩa đồng hồ (4.10) và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi (4.1) có độ phóng đại từ\r\n10 đến 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim (4.11) gắp tuyến\r\ntrùng lên lam (4.12) và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 lần đến\r\n1 000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thủy tinh.
\r\n\r\n7.2.2.2.2 Phương pháp\r\nphễu lọc Baermann cải tiến
\r\n\r\nChuẩn bị khay (4.14) và lưới lọc (4.9)\r\ncó đường kính mắt lưới 2 mm. Đặt lớp giấy lọc lên trên mặt lưới. Cân lượng đất\r\ncần kiểm tra (tối thiểu là 100 gam) và rải đều trên mặt giấy. Thao tác đặt giấy\r\nvà rải đất phải thật nhẹ để tránh rách, thủng giấy lọc. Đổ nước theo mép khay\r\nsao cho nước vừa ướt đất. Sau 24 giờ đến 48 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thủy\r\ntinh (4.10) và kiểm tra dần bằng đĩa đồng hồ (4.10) dưới kính lúp soi nổi (4.1)\r\ncó độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim (4.11)\r\ngắp tuyến trùng lên lam (4.12) và quan sát dưới kính hiển vi (4.2) có độ phóng\r\nđại từ 40 lần đến 1\r\n000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thủy tinh.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Lưới lọc phải có chân hoặc\r\nquai (gác lên thành khay) để khi đặt trong khay, đáy của lưới lọc không chạm sát đáy khay.
\r\n\r\n7.2.2.2.3 Phương pháp\r\nly tâm
\r\n\r\nCân 100 gam đất vào cốc thủy tinh\r\n(4.10), thêm 250 ml nước, khuấy đều. Lọc qua rây (4.9) có đường kính mắt rây 1\r\n200 μm, dùng vòi nước rửa kỹ phần trên rây, loại bỏ phần cặn còn lại trên rây.\r\nThu phần nước dưới rây, thêm nước cho đủ 1 lít và khuấy đều.
\r\n\r\nLấy 100 ml dung dịch thu được ở trên\r\nvào ống li tâm. Thêm 01 thìa cà phê bột cao lanh (5.8) vào ống và khuấy\r\nđều bằng máy khuấy. Đặt ống nghiệm vào máy và ly tâm (4.3) với vận tốc 1 800\r\nvòng/phút trong 4 phút.
\r\n\r\nBỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại\r\nphần cặn phía dưới. Thêm dung dịch kẽm sunphat hoặc magiê sunphat hoặc đường\r\nsaccaroza (5.1) (cao hơn 1cm so với bề mặt của lớp cặn). Khuấy đều trong 1 phút.\r\nTiếp tục ly tâm với vận tốc 1 800 vòng/phút trong 4 phút.
\r\n\r\nĐổ dung dịch phía trên qua rây lọc có đường kính 5\r\ngm. Rửa phần trên rây bằng nước sạch và dùng bình xịt nước để rửa, thu tuyến\r\ntrùng bám dính trên rây vào cốc thủy tinh (4.10).
\r\n\r\nDùng pipet (4.10) hút lấy dung dịch\r\nthu được ở cốc thủy tinh cho vào đĩa đồng hồ (4.10) và kiểm tra dưới kính lúp\r\nsoi nổi (4.1) có độ phóng đại\r\ntừ 10 đến 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim (4.11) gắp\r\ntuyến trùng lên lam kính (4.12) và quan sát dưới kính hiển vi (4.2) có độ phóng đại\r\ntừ 40 lần đến 1 000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thủy\r\ntinh.
\r\n\r\n7.2.2.3 Dung dịch bảo\r\nquản tuyến trùng
\r\n\r\nTuyến\r\ntrùng ký sinh thực vật thu được từ một trong các phương pháp tách lọc nêu ở\r\nđiều\r\n7.2.2 được đưa vào một trong ba loại dung dịch dưới đây để bảo quản tuyến trùng\r\ntrước khi tiến hành xử lý, làm tiêu bản tuyến trùng.
\r\n\r\nBảo quản các dung dịch này trong lọ thủy\r\ntinh có nắp đậy kín, ở nhiệt độ phòng và sử dụng không quá 10 ngày.
\r\n\r\nĐể tiêu bản tuyến trùng giữ được hình\r\ndáng đặc trưng, trước khi cho vào dung dịch bảo quản nên xử lý nhiệt tuyến\r\ntrùng bằng nước nóng ở nhiệt độ từ 70 °C đến 80 °C trong 5 phút.
\r\n\r\n7.2.2.3.1 Dung dịch\r\nFormalin 4 %\r\n(xem A.1.1)
\r\n\r\n7.2.2.3.2 Dung dịch\r\nFormalin - glycerol (FG) (xem A.1.2)
\r\n\r\n7.2.2.3.3 Dung dịch TAF (xem A.1.3)
\r\n\r\n\r\n\r\n8.1 Giám định\r\nbằng phương pháp quan sát các đặc điểm hình thái
\r\n\r\nGiám định tuyến trùng bằng phương pháp\r\nquan sát các đặc điểm hình thái dưới kính hiển vi (4.2) (độ phóng đại từ 40 lần\r\nđến 1 000 lần) đối với tiêu bản các cá thể tuyến trùng non, tuyến trùng cái và\r\nđực trưởng thành.
\r\n\r\n8.1.1 Làm tiêu bản\r\ntuyến trùng giám định
\r\n\r\n8.1.1.1 Làm tiêu bản\r\nphần sau tuyến trùng bào nang và con cái trưởng thành tuyến trùng nốt sần rễ (lỗ\r\nsinh dục và lỗ hậu môn)
\r\n\r\n8.1.1.1.1 Làm tiêu bản\r\nphần sau tuyến trùng bào nang
\r\n\r\nChuyển tuyến trùng bào\r\nnang đã tách lọc ngâm trong nước 24 giờ. Lấy 1 cá thể tuyến trùng bào\r\nnang, quan sát dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần (4.1)\r\nvà dùng dao mổ (4.19) cắt lấy phần sau có lỗ sinh dục (xem hình 2) và làm sạch các phần\r\nbám dính trên mảnh cắt.
\r\n\r\nLấy lam kính (4.12) và làm vòng\r\nparaphin hoặc sáp ong (5.7) (đường kính khoảng 1 cm) trên lam kính. Cho 1 giọt\r\nglycerol nguyên chất vào giữa vòng paraphin hoặc sáp ong. Dùng kim (4.11) gắp,\r\ngắp phần sau có hậu môn đặt vào giữa giọt glycerol, chỉnh cho mảnh cắt nằm úp xuống. Đậy lamen\r\n(4.13) và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho paraphin hoặc sáp ong tan chảy. Nhấc\r\nnhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn keo (5.9) bảo vệ.
\r\n\r\n\r\n\r\n
Hình 2 - Cách\r\nlàm tiêu bản phần sau tuyến trùng bào nang
\r\n\r\n8.1.1.1.2 Làm tiêu bản\r\nphần sau con cái tuyến trùng nốt sần rễ
\r\n\r\nChuyển tuyến trùng cái trưởng thành đã\r\ntách vào trong dung dịch a xít lactic 40 % (5.11) trong 12 giờ. Lấy 1 cá thể\r\ntuyến trùng cái, quan sát dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 lần đến\r\n40 lần (4.1) và dùng dao mổ (4.19) cắt phần đầu cho dịch cơ thể thoát ra. Lấy\r\nphần thân có hậu môn và lỗ sinh dục (xem hình 3) cắt gọn và làm sạch các phần\r\nbám dính trên mảnh cắt.
\r\n\r\nLấy lam kính (4.12) và làm vòng\r\nparaphin hoặc sáp ong (5.7) (đường kính khoảng 1 cm) trên lam kính. Cho 1 giọt\r\nglycerol nguyên chất vào giữa vòng paraphin hoặc sáp ong. Dùng kim (4.11) gắp,\r\ngắp phần đầu hoặc mảnh cắt phần sau đặt vào giữa giọt glycerol. Đậy lamen\r\n(4.13) và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho paraphin hoặc sáp ong (5.7) tan chảy.\r\nNhấc nhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn keo (5.9) bảo vệ.
\r\n\r\n\r\n\r\n
Hình 3 - Cách làm\r\ntiêu bản phần sau con cái trưởng thành
\r\n\r\n8.1.1.2 Làm tiêu bản\r\ntuyến trùng ký sinh thực vật (hình giun)
\r\n\r\n8.1.1.2.1 Dung dịch xử\r\nlý tuyến trùng
\r\n\r\nDung dịch xử lý
\r\n\r\n- Dung dịch 1 (xem A.2.1)
\r\n\r\n- Dung dịch 2 (xem A.2.2)
\r\n\r\nBảo quản các dung dịch này trong lọ thủy\r\ntinh có nắp đậy kín, ở nhiệt độ\r\nphòng và sử dụng không quá 10 ngày.
\r\n\r\n8.1.1.2.2 Cách tiến\r\nhành
\r\n\r\nGắp tuyến trùng từ dung dịch bảo quản\r\nvào chén thủy tinh (4.10) có chứa 0,5 ml dung dịch xử lý (dung dịch 1). Đặt\r\nchén này trong bình hút ẩm (4.6) đậy kín (bình hút ẩm có chứa 1/10 thể tích là\r\ncồn 96 %\r\n(5.5)).\r\nBình hút ẩm được đặt trong tủ ấm (4.7) ở điều kiện nhiệt độ cố định 40 °C với\r\nthời gian tối thiểu là 12 giờ.
\r\n\r\nSau 12h, lấy chén thủy\r\ntinh ra khỏi bình hút ẩm (có chứa cồn), thêm dung dịch xử lý (dung dịch 2). Đậy\r\nnắp 2/3 phần miệng chén để cồn bay hơi từ từ. Chén thủy tinh có chứa tuyến\r\ntrùng tiếp tục giữ trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ cố định 40 °C. Sau 2 giờ đến\r\n3 giờ bổ sung thêm dung dịch 2 vào chén thủy tinh cho gần\r\nđầy, lặp lại bước này từ 2 lần đến 3 lần. Tới khi chén thủy tinh chỉ còn lại\r\nglycerol có chứa tuyến trùng và có thể sử dụng làm tiêu bản cố định được.
\r\n\r\nHoặc đặt chén thủy tinh chứa tuyến\r\ntrùng trong glycerol nguyên chất trong bình hút ẩm có chứa canxi oxit (5.10). Bảo\r\nquản lâu dài để làm tiêu bản cố định.
\r\n\r\n8.1.1.2.3 Làm tiêu bản
\r\n\r\nLấy lam kính (4.12) và làm vòng\r\nparaphin hoặc sáp ong (5.7) (đường kính khoảng 1 cm) trên lam kính. Cho 1 giọt\r\nglycerol nguyên chất vào giữa vòng paraphin hoặc sáp ong. Dùng kim (4.11) gắp,\r\ngắp 5 cá thể tuyến trùng (đã xử\r\nlý trong dung dịch bảo quản) đặt vào giữa giọt glycerol, chỉnh cho các cá thể tuyến\r\ntrùng nằm cùng một hướng. Đậy lamen (4.13) và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho\r\nparaphin hoặc sáp ong (5.7) tan chảy. Nhấc nhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn\r\nkeo (5.9) bảo vệ.
\r\n\r\n8.1.2 Các đặc điểm hình thái\r\ngiám định
\r\n\r\nQuan sát, đo đếm và so sánh với các đặc\r\nđiểm hình thái đặc trưng của loài tuyến trùng theo khóa phân loại hiện có.
\r\n\r\nCác chỉ số và chữ viết tắt sử dụng khi\r\nđo đếm và giám định tuyến trùng
\r\n\r\nn: Tổng số cá thể quan sát, đo đếm.
\r\n\r\nL: Tổng chiều dài cơ thể
\r\n\r\na: Chiều dài cơ thể/chiều rộng lớn nhất\r\n(thường là vị trí lỗ sinh dục)
\r\n\r\nb: Chiều dài cơ thể/chiều dài từ đỉnh\r\nđầu cơ thể đến van ruột-thực quản
\r\n\r\nb’: Chiều dài cơ thể/chiều dài từ đỉnh đầu\r\ncơ thể đến hết điều tuyến
\r\n\r\nc: Chiều dài cơ thể/chiều dài đuôi
\r\n\r\nc’: Chiều dài đuôi/chiều rộng cơ thể tại\r\nhậu môn (con cái) hoặc lỗ huyệt (con đực)
\r\n\r\nV: Chiều dài cơ thể từ đỉnh đến lỗ\r\nsinh dục x 100/chiều dài cơ\r\nthể
\r\n\r\nT: Chiều dài từ lỗ huyệt đến đỉnh của tinh\r\nhoàn x 100/chiều\r\ndài cơ thể
\r\n\r\nO: khoảng cách từ gốc kim hút đến lỗ mở\r\ntuyến thực quản lưng Chiều dài kim hút (stylet)
\r\n\r\nChiều dài gai sinh dục con đực\r\n(spicule)
\r\n\r\n8.2 Giám định\r\nbằng phương pháp sinh học phân tử
\r\n\r\nTùy từng loài tuyến trùng cụ thể, có thể áp dụng\r\nmột hoặc một số các kỹ thuật sinh học phân tử sau để định loại tới loài:
\r\n\r\n- Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain\r\nreaction - PCR).
\r\n\r\n- Phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực\r\n(Real time - PCR)
\r\n\r\n- Mã vạch DNA (DNA barcoding).
\r\n\r\n- Chỉ thị đa hình chiều dài đoạn cắt\r\ngiới hạn (Restriction fragment length polymorphism - RFLP).
\r\n\r\n- Trình tự DNA (DNA sequencing).
\r\n\r\n\r\n\r\nNội dung phiếu kết quả giám định gồm\r\nnhững thông tin cơ bản sau:
\r\n\r\n- Thông tin về mẫu giám định.
\r\n\r\n- Tên khoa học của loài Phương pháp\r\ngiám định
\r\n\r\n- Tài liệu giám định
\r\n\r\n- Người giám định/cơ quan giám định
\r\n\r\nPhiếu kết quả giám định chi tiết có thể tham khảo\r\nphụ B.
\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n
Dung dịch xử lý mẫu, làm tiêu bản và bảo quản mẫu
\r\n\r\nA.1 Dung dịch bảo\r\nquản tuyến trùng
\r\n\r\nA.1.1 Dung dịch 1:\r\nFormalin 4 %
\r\n\r\n- Thành phần:
\r\n\r\n\r\n Formaldehyde 40 % \r\n | \r\n \r\n 10 ml \r\n | \r\n
\r\n Nước cất \r\n | \r\n \r\n 90 ml \r\n | \r\n
- Chuẩn bị:
\r\n\r\nHòa tan Formaldehyde trong nước.
\r\n\r\nA.1.2 Dung dịch 2:\r\nFormalin - glycerol (FG) 4%
\r\n\r\n- Thành phần:
\r\n\r\n\r\n Formaldehyde 40 % \r\n | \r\n \r\n 10 ml \r\n | \r\n
\r\n Glycerol \r\n | \r\n \r\n 01 ml \r\n | \r\n
\r\n Nước cất \r\n | \r\n \r\n 89 ml \r\n | \r\n
- Chuẩn bị:
\r\n\r\nHòa tan các thành phần trên trong nước.
\r\n\r\nA.1.3 Dung dịch 3:\r\nTAF
\r\n\r\n- Thành phần:
\r\n\r\n\r\n Triethanolamine \r\n | \r\n \r\n 02 ml \r\n | \r\n
\r\n Formaldehyde 40 % \r\n | \r\n \r\n 07 ml \r\n | \r\n
\r\n Nước cất \r\n | \r\n \r\n 91 ml \r\n | \r\n
- Chuẩn bị:
\r\n\r\nHòa tan các thành phần trên trong nước.
\r\n\r\nA.2 Dung dịch xử\r\nlý
\r\n\r\nA.2.1 Dung dịch 1:
\r\n\r\n+ Thành phần:
\r\n\r\n\r\n Cồn 96 % \r\n | \r\n \r\n 20 ml \r\n | \r\n
\r\n Glycerol \r\n | \r\n \r\n 01 ml \r\n | \r\n
\r\n Nước cất \r\n | \r\n \r\n 79 ml \r\n | \r\n
+ Chuẩn bị: Hòa tan các thành phần\r\ntrên trong nước.
\r\n\r\nA.2.2. Dung dịch 2:
\r\n\r\n+ Thành phần
\r\n\r\n\r\n Cồn 96 % \r\n | \r\n \r\n 95 ml \r\n | \r\n
\r\n Glycerol \r\n | \r\n \r\n 05 ml \r\n | \r\n
+ Chuẩn bị: Hòa tan glycerol trong cồn.
\r\n\r\nBảo quản các dung dịch này trong lọ thủy\r\ntinh có nắp đậy kín, ở nhiệt độ\r\nphòng và sử dụng không quá 10 ngày.
\r\n\r\nA.3. Dung dịch\r\nNaCI 20 %
\r\n\r\n+ Thành phần:
\r\n\r\n\r\n Muối Clorua natri tinh khiết (NaCI) \r\n | \r\n \r\n 20 g \r\n | \r\n
\r\n Nước cất \r\n | \r\n \r\n 80 ml \r\n | \r\n
+ Chuẩn bị: Hòa tan các thành phần\r\ntrên trong nước.
\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n
\r\n Cơ quan Giám định \r\n………………………… \r\n | \r\n \r\n CỘNG HÒA XÃ\r\n HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM | \r\n
\r\n \r\n | \r\n \r\n ……… ngày...\r\n tháng ... năm 20 ….. \r\n | \r\n
PHIẾU KẾT QUẢ\r\nGIÁM ĐỊNH
\r\n\r\n1. Tên hàng hóa:
\r\n\r\n2. Nước xuất khẩu:
\r\n\r\n3. Xuất xứ:
\r\n\r\n4. Phương tiện vận chuyển: \r\nKhối lượng:
\r\n\r\n5. Địa điểm lấy mẫu:
\r\n\r\n6. Ngày lấy mẫu:
\r\n\r\n7. Người lấy mẫu:
\r\n\r\n8. Tình trạng mẫu:
\r\n\r\n9. Ký hiệu mẫu:
\r\n\r\n10. Số mẫu lưu:
\r\n\r\n11. Người giám định:
\r\n\r\n12. Phương pháp giám định: Theo TCVN….. về “Quy\r\ntrình giám định tuyến trùng gây bệnh thực vật - Phần\r\n2-....: Yêu cầu cụ thể đối với…… (nêu tên loài cụ thể)”.
\r\n\r\n13. Kết quả giám định:
\r\n\r\nTên khoa học:
\r\n\r\nBộ:
\r\n\r\nBộ phụ:
\r\n\r\nHọ:
\r\n\r\nGiống:
\r\n\r\nLoài:
\r\n\r\n\r\n\r\n
\r\n TRƯỞNG\r\n PHÒNG KỸ THUẬT | \r\n \r\n THỦ TRƯỞNG\r\n ĐƠN VỊ | \r\n
\r\n\r\n
Thư mục tài\r\nliệu tham khảo
\r\n\r\n[1] Luc M, Sikora RA, Bridge J,\r\n(1990). Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture.\r\nWallingford, UK: CAB International, 69-108.
\r\n\r\n[2] CABI, (2017). Crop Protection\r\nCompedium
\r\n\r\n[3] IPPC, (2006), ISPM 27\r\nDiagnostic protocols for regulated pests
\r\n\r\n[4] TCVN 1-2:2008, Phần 2: Quy định về\r\ntrình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.
\r\n\r\n[5] Southey, J.F. (1986.) Laboratory\r\nmethods for work with plant and soil nematodes
\r\n\r\n[6] Tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia TCVN\r\n4731- 1989: Kiểm dịch thực vật - Phương pháp lấy mẫu.
\r\n\r\n[7] Viện Bảo vệ thực vật (1997).\r\nPhương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật. Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch\r\nhại nông nghiệp và thiên địch của chúng. NXB Nông nghiệp.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12194-1:2019 về Quy trình giám định tuyến trùng gây bệnh thực vật – Phần 1: Yêu cầu chung đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12194-1:2019 về Quy trình giám định tuyến trùng gây bệnh thực vật – Phần 1: Yêu cầu chung
Tóm tắt
Cơ quan ban hành | Đã xác định |
Số hiệu | TCVN12194-1:2019 |
Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
Người ký | Đã xác định |
Ngày ban hành | 2019-01-01 |
Ngày hiệu lực | |
Lĩnh vực | Nông nghiệp |
Tình trạng | Còn hiệu lực |