Lời nói đ
TCVN 12371-2-1: 2018 do Trung tâm Giám\r\nđịnh Kiểm dịch thực vật - Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát\r\ntriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ\r\nKhoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\nBộ TCVN 12371 Quy trình gi
- Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với Plum\r\npox virus
\r\n\r\n- Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với vi\r\nkhuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.
\r\n\r\n\r\n\r\n
Tiêu chuẩn này quy định quy trình giám\r\nđịnh virus Plum pox virus gây bệnh thực vật.
\r\n\r\n\r\n\r\nTà
TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch t
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông\r\nthường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau:
\r\n\r\n3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh\r\nkhiết phân tích, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
5.1.1
Lấy mẫu theo TCVN 8597: 2010
\r\n\r\n5.1.2
- Diện tích điều tra: phụ thuộc vào\r\nloại cây trồng, điều kiện cụ thể tại vùng điều tra và mục đích điều tra.
\r\n\r\n- Chọn điểm điều tra: Có thể chọn điểm\r\nđiều tra thẹo một trong số các phương pháp sau
\r\n\r\n+ Chọn điểm theo đường chéo góc (hình\r\n1)
\r\n\r\n+ Chọn điểm theo ô bàn cờ (hình 2)
\r\n\r\n+ Chọn điểm hình rẻ quạt (h
+ Chọn điểm ngẫu nhiên (hình 4)
\r\n\r\n+ Điều tra toàn bộ ruộng theo băng (h
- Số lượng mẫu: s
+ Cây ăn quả, cây lâu năm, cây công\r\nnghiệp: số lượng cây điều tra tại một điểm tối thiểu từ 3 cây đến 5 cây.
\r\n\r\n+ Cây hàng năm, rau màu, cây ngắn\r\nngày: mỗi điểm có diện tích tối thiểu là
Thu toàn bộ các bộ phận có triệu chứng\r\nnghi bị nhiễm Plum pox virus.
\r\n\r\n\r\n\r\nCác bộ phận tươi (cành, lá, thân, quả)\r\nđược chứa trong các túi chứa mẫu (3.1) bảo quản trong tủ lạnh sâu (3.2) ở nhiệt\r\nđộ âm 80 °C.
\r\n\r\nCác mẫu tươi sau khi giám định hoặc\r\ngửi đi giám định có thể xử lý theo một số phương pháp như
Làm mẫu khô:
\r\n\r\nBộ phận nhiễm bệnh (lá hoặc cành) được\r\nđặt trong túi chứa mẫu có chứa silicagel. (Chú ý thay silicagel mới khi\r\nphần cũ đã hút ẩm tối đa)
\r\n\r\nMẫu đạt tiêu chuẩn là các mẫu không b
Các mẫu vật sau khi ép khô được đặt\r\ntrong các tú
Các túi chứa mẫu bằng giấy được lưu\r\ntrữ trong các tủ lưu trữ mẫu (3.4) (hoặc các hộp (3.5)) có độ ẩm thấp (có thể\r\nsử dụng các vật liệu chống ẩm như silicagel...)
\r\n\r\nNgâm mẫu:
\r\n\r\nBộ phận nhiễm bệnh (cành, lá, quả\r\ntươi) được rửa nhẹ dưới với nước chảy sau đó rửa lại bằng nước cất vô\r\ntrùng.
\r\n\r\nMẫu được để chỗ thoáng để bề mặt khô\r\nhoàn toàn.
\r\n\r\nCó
Vớt mẫu vật ra
Chuyển mẫu vào lọ ngâm mẫu (3.6) có\r\nchứa dung dịch bảo quản (Xem phụ lục B) và đậy chặt nắp.
\r\n\r\n……
\r\n\r\nBước 9: loại bỏ dịch
Bước 10: thêm vào cột ly tâm màu hồng\r\n700 μ
Bước 11: ly tâm ở 10.000 vòng/phút\r\ntrong 15 giây
\r\n\r\nBước 12: loại bỏ dịch ở ống 2 ml
\r\n\r\nBước 13: ly tâm ở 10.000 vòng/phút\r\ntrong 2 phút
\r\n\r\nBước 14: đặt cột ly tâm màu hồng vào\r\nống ly tâm 1,5 ml mới
\r\n\r\nBước 15: thêm 30 μ
Bước 13: ly tâm ở 10.000 vòng/phút\r\ntrong 1 phút
\r\n\r\n7.2.2
DNA thu được tiến hành nhân gen trong\r\nmáy chu trình nhiệt (PCR) (3.10) với quy trình như sau:
\r\n\r\nBước 1: Pha dung dịch nhân gen (master\r\nmix)
\r\n\r\nMaster mix A
\r\n\r\n| \r\n Nước cất vô trùng \r\n | \r\n \r\n 1 μl \r\n | \r\n
| \r\n 5x first strand buffer \r\n | \r\n \r\n 2 μl \r\n | \r\n
| \r\n 40U/μ | \r\n \r\n 1 μl \r\n | \r\n
| \r\n Mồi \r\n | \r\n \r\n 2 μl \r\n | \r\n
| \r\n RNA khuôn \r\n | \r\n \r\n 2 μl \r\n | \r\n
Bướ
Bước 3: Ly tâm 10.000 v
Bước 4: Đặt ở nhiệt độ phòng 15 phút
\r\n\r\nBước 5: Pha dung dịch nhân gen (master\r\nmix)
\r\n\r\nMaster mix B
\r\n\r\n| \r\n 0, | \r\n \r\n 1,0 μl \r\n | \r\n
| \r\n 40U/μ | \r\n \r\n 0,25 μl \r\n | \r\n
| \r\n 10nM dNTPs \r\n | \r\n \r\n 0,5 μl \r\n | \r\n
| \r\n Reverse transcriptase \r\n | \r\n \r\n 0,25 μl \r\n | \r\n
Bước 6: trộn 2μ
Bước 7: Ủ ở 42°C đến 50 °C trong 1 giờ
\r\n\r\nBước 8: Qua 7 bước trên ta thu được\r\ncDNA từ đó tiến hành nhân gen như sau
\r\n\r\n| \r\n 10x | \r\n \r\n 2 μl \r\n | \r\n
| \r\n Nước cất vô trùng \r\n | \r\n \r\n 12,2 μl \r\n | \r\n
| \r\n 25 | \r\n \r\n 1,2 μl \r\n | \r\n
| \r\n 10 mM dNTPs \r\n | \r\n \r\n 0,4 μl \r\n | \r\n
| \r\n 5 μ | \r\n \r\n 2 μl \r\n | \r\n
| \r\n Taq polymerase (5 U/ | \r\n \r\n 0,2 μl \r\n | \r\n
| \r\n cNDA \r\n | \r\n \r\n 2 μl \r\n | \r\n
| \r\n Tổng \r\n | \r\n \r\n 20 μl \r\n | \r\n
Sử dụng cắp mồi đặc hiệu (nguồn Wetzel\r\net al.)
\r\n\r\nP1 (5’-ACC GAG ACC ACT ACA CTC CC-3
P2 (5’
Bướ
| \r\n 45 °C trong 45 phút \r\n94 °C trong 2 phút \r\n94 °C trong 30 giây \r\n60 °C trong 30 giây \r\n72 °C trong 1 phút \r\n72 °C trong 10 | \r\n \r\n Chu trình lặp lại\r\n 40 lần \r\n | \r\n
7.2.3.
Gen sau khi nhân được nhuộm bằng chất\r\nnhuộm (thường là Loading dye) sau đó được đặt vào máy điện di (3.11) trong bản\r\ngel agarose 2 %.
\r\n\r\nMẫ
Mẫu giám định được kết luận là loài\r\nPlum pox virus khi:
\r\n\r\n- Phương pháp ELISA cho kết quả là\r\ndương tính,
\r\n\r\nhoặc
\r\n\r\n- Phương pháp RT- PCR cho kết quả là\r\ndương tính.
\r\n\r\nSau khi khẳng định kết quả giám định,\r\nngười giám định hoặc cơ quan giám định trả lời kết quả bằng phiếu. Nội dung\r\nphiếu kết quả giám định gồm những thông tin sau:
\r\n\r\n- Thông tin về mẫu giám định.
\r\n\r\n- Tên loài
\r\n\r\n- Phương pháp giám định
\r\n\r\n- Người giám định/cơ quan giám định
\r\n\r\nPhiếu giám đị
\r\n\r\n
A.1 Tên khoa học và vị trí phân loại
\r\n\r\nTên tiếng Việt: Bệnh virus đốm tròn\r\nquả mận
\r\n\r\nTên khoa học: Plum pox virus
\r\n\r\nTên khác (Syn.):
\r\n\r\nAnnulus pruni
\r\n\r\nPlum pox potyvirus
\r\n\r\nPrunus virus 7
\r\n\r\nSharks virus
\r\n\r\nVị
Họ: Potyviridae
\r\n\r\nChi: Potyvirus
\r\n\r\nA.2 Phân bố
\r\n\r\nTrong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam
\r\n\r\nTrên thế giới: Ch
A.3 Ký chủ
\r\n\r\nKý chủ chính:
Ký chủ khác: Cichorlum,\r\nCirsium arvense, Clematis, Convolvulus arvensis, Euonymus europaeus,
A.4 Đặc điểm sinh học
\r\n\r\nVirus gây hại chính trên những cây\r\nthuộc chi Prunus. Virus lan truyền bằng việc ghép cây, qua hai loài rệp chính Aphis\r\nspiraecola và Myzus persicae, ngoài ra còn một số loài rệp khác cũng\r\ncó thể truyền virus với tần suất thấp như: Aphis craccivora, Aphis fabae,\r\nBrachycaudus cardui, Brachycaudus helychrysi, Brachycaudus persicae,\r\nHyalopterus pruni, Myzus varians và Phorodon humulr, Aphis gossypii,
Những cây họ Prunus bị nhiễm là nguồn\r\nlây nhiễm chính. Virus lan truyền từ cây bị bệnh qua việc ghép cây hoặc vector\r\nlà rệp Aphis spiraecola và Myzus persicae. Virus truyền bệnh bằng môi giới theo\r\nphương thức không bền vững.
\r\n\r\nCác loài
Số
Vào mùa hè, các con rệp cũng c
Theo Németh và Kölber (1983), virus\r\ntruyền qua hạt họ Prunus, nhưng điều này chưa được xác minh b
\r\n\r\n
Dung dịch bảo quản
\r\n\r\nCó thể sử dụng một trong những dung\r\ndịch bảo quản sau:
\r\n\r\nDung dịch 1:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n 85 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 28,4 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 2485 ml \r\n | \r\n
Dung dịch 2:
\r\n\r\n| \r\n 284 ml \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n 3785 ml \r\n | \r\n
Dung dịch 3:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n 1.000 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 500 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 870 ml \r\n | \r\n
Dung dịch 4:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n 450 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 540 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 1.810 ml \r\n | \r\n
Cách pha dung dịch muối bão hòa:
\r\n\r\nHòa tan muối trong nước nóng đến mức\r\nđộ bão hòa. Để dung dịch nguội trong 3 giờ.
\r\n\r\nLọc bỏ
CHÚ
\r\n\r\n
C.1
Thành phần
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n 8g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,2 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 2,9 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,2 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 1.000 ml \r\n | \r\n
C.2
Thành phần
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n 2 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 10 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 4 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 28 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 100 ml \r\n | \r\n
C.3
Thành phần
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n 1 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,2 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 100 ml \r\n | \r\n
\r\n\r\n
| \r\n Cơ quan Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật \r\n…………………………… \r\n | \r\n \r\n
| \r\n
1. Tên hàng hoá:
\r\n\r\n2. Nước xuất khẩu:
\r\n\r\n3. Xuất xứ:
\r\n\r\n4. Phương tiện vận chuyển:
5. Địa điểm lấy mẫu:
\r\n\r\n6. Ngày lấy mẫu:
\r\n\r\n7. Người lấy mẫu:
\r\n\r\n8. Tình trạng mẫu:
\r\n\r\n9. Ký hiệu mẫu:
\r\n\r\n10. Số mẫu lưu:
\r\n\r\n11. Người giám định:
\r\n\r\n12. Phương pháp giám định: Theo TCVN\r\n12371-2-1:2018, Quy trình giám định bệnh vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh\r\nthực vật. Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với virus Plum pox virus.
\r\n\r\n13. Kết quả giám định:
\r\n\r\nTên khoa học: Plum pox virus
\r\n\r\nVị trí phân loại
\r\n\r\nHọ: Potyviridae
\r\n\r\nGiống: Potyvirus
\r\n\r\n\r\n\r\n
| \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n
\r\n\r\n
[1] CABI, (2017), Crop Protection\r\nCompedium.
\r\n\r\n[2] Commonwealth Mycologycal\r\nInstitute, (1983), Plant Pathologist's Pocketbook.
\r\n\r\n[3] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic\r\nprotocols for regulated pests.
\r\n\r\n[4] TCVN 8597: 2010,
[5] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập\r\n1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng,\r\nPhương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật.. NXB Nông nghiệp.
\r\n\r\n[6] Wetzel T, Candresse T,\r\nRavelonandro M, Dunez J, (1991), A polymerase chain reaction assay\r\nadapted to plum pox potyvirus detection. Journal of\r\nVirological Methods 33, 355- 365.
\r\n\r\n[7] http://www.apsnet.org/publications/apsnetfeatures/pages/plumpoxpotyvirus.aspx.
\r\n\r\n[8] http://www.planthealthaustralia.com.au/pests/plum-pox-virus/
\r\n\r\n[9]\r\nhttps://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/planthealth/plant-pest-and-disease-programs/pests-\r\nand-diseases/plum-pox/ct_background
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-1:2018 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật – Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với virus Plum pox virus đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-1:2018 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật – Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với virus Plum pox virus
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN12371-2-1:2018 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2018-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |