\r\n\r\n
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
\r\n\r\n
TCVN 6599 : 2000
\r\n\r\n
ISO 6651 : 1987
\r\n\r\n
THỨC ĂN CHĂN NUÔI -\r\nXÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN B1
\r\nAnimal feeding stuffs - Determination\r\nof aflatoxin B1 content
\r\n\r\n
TCVN 6599:2000 hoàn toàn tương đương với ISO\r\n6651:1987.
\r\n\r\n
1.\r\nPhạm vi áp dụng
\r\n\r\n
Tiêu chuẩn này qui định hai phương pháp xác định hàm\r\nlượng aflatoxin B1, trong thức ăn chăn nuôi.
\r\n\r\n
2.\r\nLĩnh vực áp dụng.
\r\n\r\n
2.1. Phương\r\npháp A: Áp dụng cho các thức ăn đơn sau:
\r\n\r\n
- Các hạt có dầu và khô dầu của chúng, đặc biệt là\r\ndừa, cùi dừa khô, hạt lanh, hạt đậu tương, hạt vừng, hạt cây cọ babassu;
\r\n\r\n
- Bột sắn;
\r\n\r\n
- Mầm ngô;
\r\n\r\n
- Ngũ cốc và các sản phẩm của ngũ cốc;
\r\n\r\n
- Bột đậu;
\r\n\r\n
- Bã và bột khoai tây.
\r\n\r\n
Trong trường hợp có những chất làm cản trở việc xác\r\nđịnh theo phương pháp A, nên xác định theo phương pháp B.
\r\n\r\n
2.2. Phương\r\npháp B: Áp dụng cho thức ăn dạng hỗn hợp\r\nvà các loại nguyên liệu thức ăn đơn không được đề cập tại điều 2.1.
\r\n\r\n
Phương pháp này không áp dụng cho thức ăn chứa bã ép\r\ncủa cam, chanh.
\r\n\r\n
2.3. Giới hạn\r\ndưới để phát hiện aflatoxin B1 là 0,01 mg/kg.
\r\n\r\n
3.\r\nTiêu chuẩn trích dẫn
\r\n\r\n
ISO 6498 Thức ăn chăn nuôi – chuẩn bị mẫu thử.
\r\n\r\n
4.\r\nNguyên tắc
\r\n\r\n
Chiết aflatoxin từ phần mẫu thử bằng clorofooc, lọc\r\nvà làm sạch phần dịch lọc qua cột silicagel.
\r\n\r\n
Cho bay hơi phần dịch lọc và hòa tan phần cặn bằng\r\nmột thể tích clorofooc xác định hoặc hỗn hợp benzen và axetonitril.
\r\n\r\n
Chấm một phần dung dịch hòa tan này trên sắc ký lớp\r\nmỏng, dùng sắc ký một chiều đối với phương pháp A và sắc ký hai chiều đối với\r\nphương pháp B.
\r\n\r\n
Xác định hàm lượng aflatoxin B1 bằng mắt\r\nthường hoặc bằng máy đo cường độ huỳnh quang, bằng cách kiểm tra sắc ký đồ dưới\r\nđèn tử ngoại và so sánh với những dung dịch chuẩn aflatoxin B1 đã\r\nbiết trước nồng độ được chấm trên cùng một bản với dịch chiết phần mẫu thử.
\r\n\r\n
Sự tạo thành dẫn xuất hemiaxetat khẳng định sự có\r\nmặt của aflatoxin B1.
\r\n\r\n
5.\r\nThuốc thử
\r\n\r\n
Tất cả các thuốc thử phải được công nhận đạt chất\r\nlượng phân tích. Nước sử dụng phải là nước cất hoặc ít nhất là nước có độ tinh\r\nkhiết tương đương.
\r\n\r\n
5.1. Clorofooc, được làm ổn định với 0,5 đến 1%\r\netanol 96% (v/v).
\r\n\r\n
5.2. N-Hexan.
\r\n\r\n
5.3. Dietyl ete khan, không chứa peroxit.
\r\n\r\n
5.4. Benzen/axetonitril, hỗn hợp theo tỷ lệ 98: 2.
\r\n\r\n
Hỗn hợp 98 thể tích Benzen với 2 thể tích\r\naxetonitril.
\r\n\r\n
5.5. Clorofooc/metanol, hỗn hợp theo tỷ lệ 97:3.
\r\n\r\n
Hỗn hợp 97 thể tích clorofooc với 3 thể tích\r\nmetanol.
\r\n\r\n
5.6. Các hệ dung môi khai triển
\r\n\r\n
5.6.1. Clorofooc/axeton, hỗn hợp theo tỷ lệ 90:10
\r\n\r\n
Hỗn hợp 90 thể tích clorofooc với 10 thể tích axeton\r\ntrong bình chưa bão hòa.
\r\n\r\n
5.6.2. Dietyl ete/metanol/ nước, hỗn hợp theo tỷ lệ\r\n96:3:1
\r\n\r\n
Hỗn hợp 96 thể tích dietyl ete với 3 thể tích\r\nmetanol và 1 thể tích nước trong bình chưa bão hòa.
\r\n\r\n
5.6.3. Dietyl ete/metanol/ nước, hỗn hợp theo tỷ lệ\r\n94:4,5:1,5
\r\n\r\n
Hỗn hợp 94 thể tích dietyl ete với 4,5 thể tích\r\nmetanol và 1,5 thể tích nước trong bình đã bão hòa.
\r\n\r\n
5.6.4. Clorofooc/ metanol, hỗn hợp theo tỷ lệ 94:6
\r\n\r\n
Hỗn hợp 94 thể tích clorofooc với 6 thể tích metanol\r\ntrong bình đã bão hòa.
\r\n\r\n
5.6.5. Clorofooc/ metanol, hỗn hợp theo tỷ lệ 97:3
\r\n\r\n
Hỗn hợp 97 thể tích Clorofooc với 3 thể tích metanol\r\ntrong bình đã bão hòa.
\r\n\r\n
5.7. Silicagel, dùng cho sắc ký cột với kích thước\r\nhạt từ 0,05 đến 0,20mm.
\r\n\r\n
5.8. Silicagel, G-HR hoặc loại tương đương dùng cho\r\nsắc ký lớp mỏng.
\r\n\r\n
5.9. Đất diatomit (Hyflocupercel), đã rửa sạch axit
\r\n\r\n
5.10. Natri sunfat, khan ở dạng hạt
\r\n\r\n
5.11. Axit trifluoroaxetic
\r\n\r\n
5.12. Khí trơ, ví dụ khí nitơ
\r\n\r\n
5.13. Dung dịch axit sunfuric, 50% (v/v).
\r\n\r\n
5.14. Dung dịch chuẩn aflatoxin B1 chứa\r\nkhoảng 0,1mg aflatoxin B1 pha trong 1 ml Clorofooc\r\n(5.1) hoặc trong 1 ml hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4).
\r\n\r\n
Cảnh báo – Các aflatoxin rất dễ gây ung thư do vậy phải được\r\nbảo quản hết sức cẩn thận.
\r\n\r\n
Chuẩn bị và kiểm tra dung dịch như sau:
\r\n\r\n
5.14.1. Chuẩn bị dung dịch gốc và xác định nồng độ
\r\n\r\n
Chuẩn bị dung dịch aflatoxin B1 trong\r\nclorofooc (5.1) hoặc trong hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4) sao cho nồng độ vào\r\nkhoảng 8 đến 10 mg/ml. Xác định phổ hấp thụ từ bước sóng 330 đến 370nm\r\nbằng quang phổ kế (6.9).
\r\n\r\n
Đo độ hấp thụ (A) tại bước sóng 363 nm đối với dung\r\ndịch clorofooc hoặc tại bước sóng 348 nm đối với dung dịch hỗn hợp\r\nbenzen/axetonitril.
\r\n\r\n
Tính nồng độ aflatoxin B1 theo mg/ml dung dịch, theo công thức sau:
\r\n\r\n
a. Đối với dung dịch clorofooc:
\r\n\r\n
![]()
\r\n\r\n
b. Đối với dung dịch hỗn hợp benzen/axetonitril:
\r\n\r\n
![]()
\r\n\r\n
5.14.2. Pha loãng
\r\n\r\n
Tiến hành pha loãng dung dịch gốc (5.14.1), tránh\r\nánh sáng, để đạt được dung dịch chuẩn có nồng độ aflatoxin B1 khoảng\r\n0,1mg/ml.
\r\n\r\n
Nếu bảo quản trong tủ lạnh ở 40C thì dung\r\ndịch có thể giữ trong 2 tuần.
\r\n\r\n
5.14.3. Kiểm tra độ tinh khiết của dung dịch bằng\r\nphương pháp sắc ký.
\r\n\r\n
Trên bản sắc ký (6.7) chấm 1 điểm 5ml dung dịch chuẩn aflatoxin B1 có nồng độ khoảng 8 đến 10 mg/ml (5.14.1). Chạy sắc ký như 8.5.1. Dưới ánh sáng tử ngoại, sắc đồ sẽ\r\ncho duy nhất một điểm và vùng lưu giữ không phát huỳnh quang.
\r\n\r\n
5.15. Aflatoxin B1 và B2 (xem\r\ncảnh báo ở 5.14) dung dịch để kiểm tra định tính chứa khoảng 0,1mg aflatoxin B1 và B2 pha trong 1 ml clorofooc\r\n(5.1) hoặc trong 1ml dung dịch hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4).
\r\n\r\n
Nồng độ này đưa ra có tính chất tham khảo. Có thể\r\nđiều chỉnh nồng độ để cả hai loại aflatoxin này có cường độ phát huỳnh quang\r\ngiống nhau (xem 8.5.1).
\r\n\r\n
6.\r\nThiết bị, dụng cụ
\r\n\r\n
Sử dụng các dụng cụ thông thường trong phòng thí\r\nnghiệm và các dụng cụ chuyên dùng sau đây:
\r\n\r\n
6.1. Máy nghiền/trộn.
\r\n\r\n
6.2. Sàng, có đường kính lỗ 1,0 mm
\r\n\r\n
6.3. Máy lắc hoặc máy khuấy từ
\r\n\r\n
6.4. Cột sắc ký, làm bằng thủy tinh (đường kính\r\ntrong 22mm, dài 300mm), bình chứa dung môi 250ml có van polytetrafluoroetylen,\r\nphía dưới cột được nút bằng bông hoặc bằng sợi thủy tinh.
\r\n\r\n
6.5. Thiết bị cất quay chân không, có bình cầu dung\r\ntích 500ml.
\r\n\r\n
6.6. Thiết bị sắc ký lớp mỏng (TLC), theo yêu cầu để\r\nchuẩn bị các bản mỏng (6.7) và dụng cụ chấm các điểm (pipet mao quản hoặc micro\r\nxi-ranh), bình khai triển và thiết bị phun axit sunfuric (5.13) lên các bản\r\nmỏng.
\r\n\r\n
6.7. Các tấm thủy tinh, cho sắc ký lớp mỏng có kích\r\nthước 200mm x 200mm được chuẩn bị như sau (với lượng làm sao đủ cho 5 bản).
\r\n\r\n
Cân 30g silicagel (5.8) cho vào một bình nón, thêm\r\n60ml nước cất, đậy nút và lắc trong 1 phút. Phun huyền phù này lên các tấm kính\r\nsao cho thu được lớp mỏng silicagel đồng nhất có độ dày 0,25mm. Để khô trong\r\nkhông khí sau đó bảo quản trong bình hút ẩm có chứa silicagel. Trước khi sử\r\ndụng hoạt hóa các tấm này bằng cách đặt trong tủ sấy ở 1100C trong 1\r\ngiờ.
\r\n\r\n
Có thể sử dụng các tấm silicagel có sẵn, nếu chúng\r\ncho kết quả tương đương với kết quả của những tấm được chuẩn bị như đã nói ở\r\ntrên.
\r\n\r\n
6.8. Đèn tử ngoại bước sóng dài (360nm).
\r\n\r\n
Cường độ phát ra sẽ giúp ta dễ dàng nhận ra điểm có\r\nnồng độ aflatoxin B1 tới 1,0 ng trên tấm TLC ở cách đèn một khoảng\r\n10cm.
\r\n\r\n
Cảnh báo- Đèn tử ngoại rất nguy hiểm đối với mắt, do đó phải\r\nđeo kính bảo vệ.
\r\n\r\n
6.9. Quang phổ kế, có thể đo trong vùng phổ tử ngoại
\r\n\r\n
6.10. Máy đo cường độ huỳnh quang (tự chọn)
\r\n\r\n
6.11. Giấy lọc đã gấp rãnh
\r\n\r\n
6.12. Ống nghiệm chia độ, dung tích 10,0ml và có nút\r\nbằng polyetylen
\r\n\r\n
6.13. Bình nón, có nút mài dung tích 500 ml.
\r\n\r\n
6.14. Pipet, dung tích 50ml
\r\n\r\n
6.15. Cân
\r\n\r\n
7.\r\nLấy mẫu
\r\n\r\n
Lấy mẫu thí nghiệm từ nguyên liệu, tuân theo tiêu\r\nchuẩn đối với từng loại nguyên liệu ngoại trừ việc lấy mẫu không nằm trong lĩnh\r\nvực áp dụng của tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn nào phù hợp, các bên\r\nliên quan sẽ phải thỏa thuận với nhau dựa theo các đặc tính của nguyên liệu\r\nmẫu.
\r\n\r\n
8.\r\nCách tiến hành
\r\n\r\n
8.1. Chuẩn bị\r\nmẫu thử
\r\n\r\n
8.1.1. Nếu mẫu có hàm lượng chất béo trên 5% thì\r\nphải loại chất béo bằng dung môi ete dầu hỏa trước khi nghiền.
\r\n\r\n
Trong trường hợp này các kết quả phân tích sẽ được\r\nbiểu thị dưới dạng khối lượng của mẫu không loại chất béo.
\r\n\r\n
8.1.2. Nghiền mẫu sao cho hoàn toàn qua được sàng\r\n(6.2). Trộn đều. (Xem ISO 6498)
\r\n\r\n
8.2. Phần thử\r\nmẫu
\r\n\r\n
Cân 50g mẫu với độ chính xác đến 0,01g, cho vào bình\r\nnón (6.13)
\r\n\r\n
8.3. Chiết\r\ntách
\r\n\r\n
Cho vào phần mẫu thử (8.2) 25g đất diatomit (5.9),\r\n25ml nước cất và 250ml clorofooc (5.1) đong chính xác bằng ống đong. Đậy nút\r\nchặt và lắc bằng máy lắc hoặc máy khuấy từ (6.3) trong 30 phút. Lọc qua giấy\r\nlọc gấp rãnh (6.11), chú ý bỏ 10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy ít nhất 50ml dịch\r\nlọc tiếp theo.
\r\n\r\n
8.4. Làm sạch\r\ncột
\r\n\r\n
8.4.1. Chuẩn bị cột
\r\n\r\n
Đổ clorofooc (5.1) đến 2/3 cột sắc ký (6.4) và thêm\r\n5g natri sunfat (5.10). Kiểm tra sao cho bề mặt natri sunfat phải thật phẳng,\r\nsau đó từ từ thêm 10g silicagel (5.7) vào mẫu phân tích. Khuấy nhẹ và cẩn thận\r\nsau mỗi lần rót silicagel để loại bỏ bọt khí. Đợi 15 phút thêm dần dần 10g\r\nnatri sunfat (5.10). Mở khóa sao cho dịch lỏng chảy xuống từ từ đến khi dịch\r\nlỏng vừa ngập bề mặt lớp natri sunfat. Khóa van lại.
\r\n\r\n
8.4.2. Làm sạch
\r\n\r\n
Dùng pipet (6.4) chuyển 50ml dịch lọc thu được ở 8.3\r\nvào bình nón 250ml và thêm 100ml dung dịch n-hexan (5.2). Trộn đều và chuyển\r\nmột cách định lượng hỗn hợp vào cột, tráng rửa bình bằng n-hexan. Mở van và cho\r\ndung dịch chảy với lưu lượng dòng khoảng 8-12 ml/phút sao cho dung dịch ngập\r\ntrên bề mặt lớp natri sunfat. Khóa van. Tiếp tục cho dung dịch chảy ra và rót\r\n100 ml dietyl ete (5.3) vào cột. Lại mở van và cho dịch lỏng chảy qua đến khi\r\nngập bề mặt lớp natri sunfat. Trong quá trình này phải đảm bảo không để cột bị\r\nkhô.
\r\n\r\n
Rửa giải bằng 150ml dung dịch hỗn hợp\r\nclorofooc/metanol (5.5) và thu toàn bộ dịch chảy ra vào bình của máy cất quay\r\nchân không dung tích 500ml (6.5). Làm bay hơi đến khô bằng máy cất quay chân\r\nkhông hoặc cũng có thể làm khô bằng dòng khí trơ (5.12) ở nhiệt độ dưới 500C\r\nvà áp suất thấp.
\r\n\r\n
Chú thích: Nếu không có máy cất quay chân không thì thêm chất\r\nlàm sôi và cho bay hơi hoàn toàn đến khô trong nồi cách thủy.
\r\n\r\n
Dùng clorofooc (5.1) hoặc hỗn hợp benzen/axetonitril\r\n(5.4) chuyển một cách định lượng phần cặn vào ống nghiệm 10ml có chia độ\r\n(6.12). Cho dung dịch bay hơi một lần nữa, ví dụ trong nồi cách thủy, tốt nhất\r\nlà dùng dòng khí trơ (5.12) và lượng clorofooc (5.1) hoặc hỗn hợp benzen/axetonitril\r\n(5.4) tối đa là 2,0 ml.
\r\n\r\n
8.5. Sắc ký\r\nlớp mỏng
\r\n\r\n
8.5.1. Phương pháp A – Sắc ký lớp mỏng một chiều
\r\n\r\n
8.5.1.1. Chọn dung môi
\r\n\r\n
Lựa chọn dung môi (5.6.1; 5.6.2; 5.6.3; 5.6.4 hoặc\r\n5.6.5) phải thực hiện trước khi khẳng định rằng aflatoxin B1 và B2\r\nđược tách ra hoàn toàn khi bản mỏng được chạy sắc ký, điều này phụ thuộc vào\r\nloại bản mỏng sử dụng.
\r\n\r\n
Chấm 25ml dung dịch chuẩn\r\n(5.15) lên bản đã chuẩn bị sẵn (6.7) (kiểm tra từng bản cho mỗi dung môi).
\r\n\r\n
Tiến hành thực hiện theo 8.5.1.2 để chạy sắc ký, cho\r\nbay hơi và chiếu đèn tử ngoại.
\r\n\r\n
Với dung môi thích hợp hai điểm sẽ được phân tách rõ\r\nràng.
\r\n\r\n
8.5.1.2. Cách tiến hành
\r\n\r\n
Dùng pipet mao quản hoặc micro xi-lanh chấm các thể\r\ntích dung dịch chuẩn aflatoxin B1 lên tấm TLC (6.7) và dịch chiết\r\nnhư sau (các điểm này cách cạnh đáy 20mm và cách nhau 20mm).
\r\n\r\n
- Lấy 10, 15, 20, 30 và 40 ml dung dịch aflatoxin B1 chuẩn (5.14).
\r\n\r\n
- Lấy 10ml dịch chiết ở\r\n8.4.2 chấm chồng lên điểm 20ml dung dịch chuẩn aflatoxin B1\r\n(5.14)
\r\n\r\n
- Lấy 10 và 20ml dịch chiết ở\r\n8.4.2.
\r\n\r\n
Chạy sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi đã chọn (xem\r\n8.5.1.1).
\r\n\r\n
Lấy bản sắc ký ra khỏi bình sắc ký, để dung môi bay\r\nhơi ở chỗ tối sau đó đem kiểm tra dưới đèn tử ngoại, đặt bản sắc ký cách đèn\r\n10cm (6.8). Các vết aflatoxin B1 sẽ cho huỳnh quang màu xanh da\r\ntrời.
\r\n\r\n
8.5.2. Phương pháp B – Sắc ký lớp mỏng hai chiều.
\r\n\r\n
8.5.2.1. Sử dụng các dung dịch (xem hình 1)
\r\n\r\n
Kẻ hai đường thẳng trên bản sắc ký (6.7) giao nhau\r\nvà song song với hai cạnh bản (một đường cách cạnh 50mm, đường kia cách cạnh\r\n60mm) để giới hạn sự di chuyển của dung môi. Dùng pipet mao quản hoặc micro\r\nxi-ranh chấm các dung dịch sau lên bản:
\r\n\r\n
- Tại điểm A: 20ml dịch\r\nchiết mẫu đã được làm sạch ở 8.4.2;
\r\n\r\n
- Tại điểm B: 20ml dung dịch\r\nchuẩn aflatoxin B1 (5.14).
\r\n\r\n
- Tại điểm C: 10ml dung dịch\r\nchuẩn aflatoxin B1 (5.14).
\r\n\r\n
- Tại điểm D: 20ml dung dịch\r\nchuẩn aflatoxin B1 (5.14).
\r\n\r\n
- Tại điểm E: 40ml dung dịch\r\nchuẩn aflatoxin B1 (5.14).
\r\n\r\n
Làm khô nhờ luồng không khí thổi nhẹ hoặc nhờ khí\r\ntrơ (5.12). Các vết chấm thu được phải có đường kính khoảng 5mm.
\r\n\r\n
8.5.2.2. Chạy sắc ký (xem hình 1)
\r\n\r\n
Chạy sắc ký theo chiều I ở chỗ tối, sử dụng dung môi\r\nkhai triển (5.6.3) (bình được bão hòa bằng một lớp dung môi 1cm) đến khi dung\r\nmôi tiến tới đường giới hạn. Lấy bản sắc ký ra khỏi bình, để khô chỗ tối ở\r\nnhiệt độ phòng ít nhất là 15 phút.
\r\n\r\n
Sau đó chạy sắc ký theo chiều II ở chỗ tối, sử dụng\r\ndung môi khai triển (5.6.1) (bình chưa bão hòa, lớp dung môi 1cm) đến khi dung\r\nmôi tiến tới đường giới hạn. Lấy bản sắc ký ra khỏi bình và để khô chỗ tối ở\r\nnhiệt độ phòng.
\r\n\r\n
8.5.2.3. Giải sắc phổ (xem hình 2)
\r\n\r\n
Kiểm tra sắc phổ dưới đèn tử ngoại, bằng cách đặt\r\nbản mỏng cách đèn 10cm (6.8). Xác định vị trí của các điểm huỳnh quang màu xanh\r\nda trời B, C, D và E của aflatoxin B1 từ dung dịch chuẩn và kẻ hai\r\nđường thẳng mờ đi qua những điểm này tạo thành các góc ở phía phải hướng chạy\r\nsắc ký. Giao điểm P của hai đường này là điểm nghi vấn có aflatoxin B1 trong\r\ndịch chiết chấm ở điểm A (xem hình 1). Tuy nhiên, vị trí thực của aflatoxin B1\r\ncó thể nằm tại điểm Q là giao điểm của hai đường kẻ ở trên tạo với nhau\r\nmột góc khoảng 1000 theo thứ tự đi qua điểm B và điểm C.
\r\n\r\n
8.5.2.4. Sắc ký bổ sung.
\r\n\r\n
Kẻ hai đường thẳng trên bản sắc ký khác (6.7) giao\r\nnhau và song song với hai cạnh bản như hình vẽ 1 và chấm ở điểm A, 20ml dịch chiết đã được làm sạch ở 8.4.2 và chấm chồng lên nó 20ml dung dịch chuẩn aflatoxin B1 (5.14). Chạy sắc ký như ở\r\n8.5.2.2. Kiểm tra sắc phổ dưới đèn tử ngoại và xem:
\r\n\r\n
- Vết aflatoxin B1 của dịch chiết và của\r\ndung dịch chuẩn phải trùng nhau;
\r\n\r\n
- Huỳnh quang của vết này phải mạnh hơn quỳnh quang\r\ncủa vết aflatoxin B1 đã khai triển ở điểm Q của bản mỏng thứ nhất.
\r\n\r\n
8.6. Xác\r\nđịnh.
\r\n\r\n
Có thể sử dụng hai phương pháp xác định bằng mắt\r\nthường hoặc bằng máy đo cường độ phát huỳnh quang.
\r\n\r\n
8.6.1. Xác định bằng mắt
\r\n\r\n
8.6.1.1. Phương pháp A
\r\n\r\n
Xác định hàm lượng aflatoxin B1 trong dịch\r\nchiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của vết dịch chiết với cường độ\r\nhuỳnh quang của vết dung dịch chuẩn. Nếu thấy cần thiết dùng phép nội suy.
\r\n\r\n
Huỳnh quang của vết dịch chiết chấm chồng lên dung\r\ndịch chuẩn phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10ml dịch\r\nchiết và phải trùng nhau. Nếu cường độ huỳnh quang của vết 10ml dịch chiết đậm hơn cường độ huỳnh quang của vết 40ml dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết 10 hoặc 100 lần bằng\r\nclorofooc (5.1) hoặc bằng dung dịch hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4) trước khi\r\ntiến hành làm lại sắc ký lớp mỏng.
\r\n\r\n
8.6.1.2. Phương pháp B
\r\n\r\n
Xác định hàm lượng aflatoxin B1 trong\r\ndịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của vết dịch chiết với cường\r\nđộ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn C, D và E. Nếu cần thiết dùng phép nội\r\nsuy.
\r\n\r\n
Nếu cường độ huỳnh quang của vết 20ml dịch chiết mạnh hơn cường độ huỳnh quang của vết 40ml dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết 10 hoặc 100 lần bằng\r\nclorofooc (5.1) hoặc bằng dung dịch hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4) trước khi\r\ntiến hành làm lại sắc ký lớp mỏng.
\r\n\r\n
8.6.2. Xác định bằng máy đo cường độ huỳnh quang
\r\n\r\n
Đo cường độ huỳnh quang của vết aflatoxin B1 bằng\r\nmáy đo cường độ huỳnh quang (6.10) tại bước sóng kích thích là 365nm và bước\r\nsóng phát xạ là 443nm.
\r\n\r\n
Đối với phương pháp A, xác định hàm lượng aflatoxin\r\nB1 trên các chấm của dịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh\r\nquang của vết dịch chiết với cường độ huỳnh quang của các vết dung dịch chuẩn\r\nvà đối với phương pháp B xác định hàm lượng aflatoxin B1 của vết\r\ndịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của vết dịch chiết với cường\r\nđộ huỳnh quang của các vết dung dịch chuẩn C, D và E.
\r\n\r\n
8.7. Khẳng\r\nđịnh sự có mặt của aflatoxin B1.
\r\n\r\n
Khẳng định sự có mặt của aflatoxin B1 trong\r\ndịch chiết bằng thử nghiệm dự đoán với axit sunfuric (xem 8.7.1) và nếu kết quả\r\ncủa phép thử này là dương tính thì tiến hành thí nghiệm thực tế (8.7.2). Nếu\r\nkết quả phép thử với axit sunfuric là âm tính thì không cần tiến hành thí\r\nnghiệm và trong trường hợp này khẳng định không có aflatoxin B1.
\r\n\r\n
8.7.1. Thử nghiệm dự đoán bằng axit sunfuric
\r\n\r\n
Phun dung dịch axit sunfuric (5.13) lên bản sắc ký ở\r\n8.5.1 hoặc ở 8.5.2. Huỳnh quang của các vết aflatoxin B1 sẽ chuyển\r\ntừ màu xanh da trời sang màu vàng dưới ánh sáng tử ngoại.
\r\n\r\n
8.7.2. Thí nghiệm khẳng định: Sự tạo thành aflatoxin\r\nB1 – hemiaxetal (aflatoxin B2a)
\r\n\r\n
Trong trường hợp đơn giản và chỉ với những thức ăn\r\ncó màu nhạt thì dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng một chiều được mô tả ở 8.7.2.1.\r\nTrường hợp những thức ăn có màu đơn, những thức ăn hỗn hợp hoặc những thức ăn\r\ncó sự nghi ngờ thì dùng phương pháp sắc ký mỏng hai chiều được mô tả ở 8.7.2.2.
\r\n\r\n
8.7.2.1. Sắc ký lớp mỏng một chiều
\r\n\r\n
Kẻ một đường thẳng trên bản sắc ký (6.7) để chia bản\r\nthành hai phần bằng nhau. Chấm lên mỗi phần, cách cạnh đáy 20mm và cách vạch\r\nphân chia 15mm các thể tích dung dịch chuẩn aflatoxin B1 và dịch\r\nchiết như sau:
\r\n\r\n
- 25 ml dung dịch chuẩn\r\naflatoxin B1 (5.14)
\r\n\r\n
- Một thể tích dịch chiết ở 8.4.2 chứa khoảng 2,5 ng\r\naflatoxin B1.
\r\n\r\n
- 25 ml dung dịch chuẩn\r\naflatoxin B1 (5.14) và chấm chồng lên nó một thể tích dịch chiết ở\r\n8.4.2 chứa khoảng 2,5 ng aflatoxin B1.
\r\n\r\n
Chọn một trong hai phần, chấm chồng lên những điểm\r\ntrước 1 đến 2ml axit trifluoroaxetic (5.11). Sấy nhẹ để làm khô các\r\nvết ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n
Chạy sắc ký ở chỗ tối dùng một trong các dung môi\r\nkhai triển (5.6). Tiến hành lựa chọn dung môi trước khi chạy sắc ký. Hệ dung\r\nmôi phải đảm bảo aflatoxin B1 – hemiaxetal (aflatoxin B2a)\r\nđược tách hoàn toàn ra khỏi các chất cản trở. Dung môi chạy khoảng 120mm.
\r\n\r\n
Để dung môi bay hơi ở chỗ tối, sau đó phun axit\r\nsunfuric (5.13) lên phần bản không chấm axit trifluoroaxetic. Kiểm tra bản sắc\r\nký dưới đèn tử ngoại.
\r\n\r\n
Khẳng định sự có mặt của aflatoxin B1 nếu:
\r\n\r\n
a. Giá trị Rf của aflatoxin B1 của\r\ndịch chiết tương tự với giá trị Rf của aflatoxin B1 của\r\ndung dịch chuẩn;
\r\n\r\n
b. Cường độ huỳnh quang của aflatoxin B1 của\r\ndung dịch chuẩn chấm chồng lên dịch chiết phải mạnh hơn cường độ huỳnh quang\r\ncủa aflatoxin B1 của dịch chiết.
\r\n\r\n
Vì các vết huỳnh quang của dịch chiết có cùng giá\r\ntrị Rf với vết huỳnh quang của aflatoxin B1 – hemiaxetal\r\ncó thể dẫn đến sự nhầm lẫn qua việc đọc sắc phổ, chính vì vậy ta phải kiểm tra\r\nsự có mặt của chúng trên phần được xử lý bằng axit sunfuric.
\r\n\r\n
Trong trường hợp không khẳng định được chính xác thì\r\nphải sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hai chiều (8.7.2.2).
\r\n\r\n
8.7.2.2. Sắc ký lớp mỏng hai chiều (xem hình 3)
\r\n\r\n
8.7.2.2.1. Chấm các dung dịch
\r\n\r\n
Kẻ hai đường thẳng trên bản sắc ký (6.7) giao nhau\r\nvà song song với hai cạnh của bản (cách mỗi cạnh 60mm) để giới hạn sự di chuyển\r\ncủa dung môi. Dùng pipet mao quản hoặc micro xi-ranh chấm các dung dịch sau lên\r\nbản sắc ký:
\r\n\r\n
- Tại điểm A: Một thể tích dịch chiết lấy từ mẫu\r\nđược làm sạch ở 8.4.2 chứa khoảng 2,5ng aflatoxin B1 và một giọt (1\r\nđến 2ml) axit trifluoroaxetic (5.11).
\r\n\r\n
- Tại điểm B và C: 25ml dung dịch\r\nchuẩn aflatoxin B1(5.14) và một giọt axit trifluoroaxetic (5.11).
\r\n\r\n
Làm khô bằng dòng không khí nóng ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n
8.7.2.2.2. Chạy sắc ký
\r\n\r\n
Chạy sắc ký theo chiều I ở chỗ tối, sử dụng dung môi\r\nkhai triển (5.6.2) (lớp dung môi khoảng 1cm trong bình chưa bão hòa) đến khi\r\ndung môi tiến tới đường giới hạn. Lấy bản sắc ký ra khỏi bình, để khô chỗ tối ở\r\nnhiệt độ phòng trong 5 phút.
\r\n\r\n
Sau đó chạy sắc ký theo chiều II ở chỗ tối, sử dụng\r\ndung môi khai triển (5.6.1) (lớp dung môi khoảng 1cm trong bình chưa bão hòa)\r\nđến khi dung môi tiến tới đường giới hạn. Lấy bản sắc ký ra khỏi bình, để khô\r\nchỗ tối ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n
8.7.2.2.3. Giải sắc phổ
\r\n\r\n
Kiểm tra sắc phổ dưới ánh sáng tử ngoại (6.8) ở\r\nnhững điểm sau:
\r\n\r\n
a. Xuất hiện vết huỳnh quang màu xanh da trời của\r\naflatoxin B1 – hemiaxetal và đôi khi vết huỳnh quang màu xanh da\r\ntrời nhạt của aflatoxin B1 không phản ứng với axit trifluoroaxetic, các\r\nvết này là của dung dịch chuẩn chấm ở điểm C (di chuyển theo hướng I) và của điểm\r\nB (di chuyển theo hướng II);
\r\n\r\n
b. Xuất hiện các vết tương tự như các vết mô tả ở\r\n(a) là của dịch chiết chấm ở điểm A. Vị trí của những vết này được xác định nhờ\r\ncác vết của dung dịch chuẩn chấm tại điểm B và C.
\r\n\r\n
8.8. Số phép\r\nxác định
\r\n\r\n
Tiến hành hai phép xác định trên cùng mẫu thử\r\nnghiệm.
\r\n\r\n
9.\r\nBiểu thị kết quả
\r\n\r\n
9.1. Cách\r\ntính và công thức
\r\n\r\n
9.1.1. Xác định bằng mắt
\r\n\r\n
Hàm lượng aflatoxin B1 tính bằng mg/kg mẫu, được tính theo công thức:
\r\n\r\n
![]()
\r\n\r\n
Trong đó:
\r\n\r\n
C: Là nồng độ dung dịch chuẩn (5.14), tính bằng mg/ml (khoảng 0,1mg/ml);
\r\n\r\n
m: Là khối lượng của phần mẫu thử tương ứng với thể\r\ntích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột, tính bằng gam (10,0g)
\r\n\r\n
V1: Là thể tích cuối cùng của dịch chiết\r\nkể cả những lần pha loãng nếu có, tính bằng microlit;
\r\n\r\n
V2 và V3: Là thể tích dịch\r\nchiết và thể tích dung dịch chuẩn aflatoxin B1 (5.14) chấm lên bản\r\nmỏng có cường độ phát huỳnh quang giống nhau, tính bằng microlit;
\r\n\r\n
9.1.2. Đo bằng máy đo cường độ huỳnh quang (mg)
\r\n\r\n
Hàm lượng aflatoxin B1 tính bằng m/kg mẫu, được tính theo công thức:
\r\n\r\n
![]()
\r\n\r\n
Trong đó:
\r\n\r\n
m: Là khối lượng của phần mẫu thử tương ứng với thể\r\ntích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột, tính bằng gam (10,0g)
\r\n\r\n
m1: Là hàm lượng aflatoxin B1 của\r\nvết chấm dịch chiết (kể cả thể tích V2), tính bằng nanogam;
\r\n\r\n
V1: Là thể tích cuối cùng của dịch chiết\r\nkể cả những lần pha loãng nếu có, tính bằng microlit;
\r\n\r\n
V2: Là thể tích của dịch chiết mẫu chấm\r\nlên bản mỏng (10 hoặc 20ml), tính bằng microlit;
\r\n\r\n
9.2. Độ chính\r\nxác
\r\n\r\n
Ba lần kiểm tra chéo, hai trong ba lần kiểm tra được\r\ntiến hành ở cấp quốc tế (Nos.1 và 2) trên thức ăn chăn nuôi hỗn hợp (phương\r\npháp B) cho ta kết quả trong bảng dưới đây:
\r\n\r\n
11 phòng thí nghiệm tham gia thử nghiệm lần 2 phân\r\ntích theo phương pháp A trên mẫu giống nhau định lượng bằng mắt hoặc bằng máy\r\nđo cường độ huỳnh quang đều cho kết quả tương tự với kết quả tiến hành theo\r\nphương pháp B.
\r\n\r\n
10.\r\nBáo cáo kết quả
\r\n\r\n
Báo cáo kết quả cần ghi rõ phương pháp đã sử dụng (A\r\nhoặc B), phương pháp xác định (bằng mắt hoặc bằng máy đo cường độ huỳnh quang)\r\nvà kết quả thu được. Báo cáo cũng phải đề cập chi tiết về các thao tác không\r\nqui định trong tiêu chuẩn này hoặc được phép lựa chọn cùng với các chi tiết của\r\nbất kỳ yếu tố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả.
\r\n\r\n
Báo cáo phải bao gồm tất cả các thông tin cần thiết\r\nđể nhận biết toàn diện về mẫu thử.
\r\n\r\n
\r\n \r\n | \r\n Thông số \r\n | \r\n \r\n Mẫu \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n 1 \r\n | \r\n \r\n 2 \r\n | \r\n \r\n 3 \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Số phòng thí nghiệm \r\n | \r\n \r\n 23 \r\n | \r\n \r\n 11 \r\n | \r\n \r\n 13 \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Giá trị trung bình \r\n | \r\n \r\n 162,7mg/kg \r\n | \r\n \r\n 25,4mg/kg \r\n | \r\n \r\n 13,4mg/kg \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Độ lệch chuẩn của độ lặp lại (Sr) \r\n | \r\n \r\n 16,9mg/kg \r\n | \r\n \r\n 2,7mg/kg \r\n | \r\n \r\n 1,7mg/kg \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Hệ số biến đổi của độ lặp lại \r\n | \r\n \r\n 10% \r\n | \r\n \r\n 11% \r\n | \r\n \r\n 13% \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Độ lặp lại (2,83Sr) \r\n | \r\n \r\n 47,8mg/kg \r\n | \r\n \r\n 7,6mg/kg \r\n | \r\n \r\n 4,8mg/kg \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Độ lệch chuẩn của độ tái lập do các phòng thử\r\n nghiệm khác nhau xác định (SR) \r\n | \r\n \r\n 45,2mg/kg \r\n | \r\n \r\n 6,8mg/kg \r\n | \r\n \r\n 4,0mg/kg \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Hệ số biến đổi của độ tái lập \r\n | \r\n \r\n 28% \r\n | \r\n \r\n 27% \r\n | \r\n \r\n 30% \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Độ tái lập (2,83SR) \r\n | \r\n \r\n 128,0mg/kg \r\n | \r\n \r\n 19,2mg/kg \r\n | \r\n \r\n 11,3mg/kg \r\n | \r\n
\r\n
\r\n\r\n
Kích thước, tính bằng milimét
\r\n\r\n
![]()
\r\n\r\n
Hình 1 – Chấm các dung dịch
\r\n\r\n
Kích thước, tính bằng milimét
\r\n\r\n
![]()
\r\n\r\n
Hình 2- Giải sắc đồ
\r\n\r\n
Kích thước, tính bằng milimét
\r\n\r\n
![]()
\r\n\r\n
Hình 3- Thử khẳng định
\r\n\r\n
