TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 6603:2000

ISO 10095:1992

CÀ PHÊ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAPHÊIN - PHƯƠNG PHÁP DÙNG\r\nSẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

Coffee\r\n- Determination of caffeine content - Method using high - performance liquid\r\nchromatography

Lời nói đầu

TCVN 6603:2000 hoàn toàn tương\r\nđương với ISO 10095:1992;

TCVN 6603:2000 do Ban kỹ thuật\r\nTCVN/TC/F16 Cà phê và sản phẩm cà phê biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường\r\nChất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành.

CÀ\r\nPHÊ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAPHÊIN - PHƯƠNG PHÁP DÙNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

Coffee\r\n- Determination of caffeine content - Method using high - performance liquid\r\nchromatography

1. Phạm vi và\r\nlĩnh vực áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp\r\nsắc ký lỏng cao áp (HPLC) để xác định hàm lượng caphêin của cà phê nhân và cà\r\nphê rang đã khử caphêin, của bột chiết của cà phê thường và cà phê đã khử\r\ncaphêin.

Chú thích 1 - Phương pháp chuẩn để\r\nxác định hàm lượng caphêin bằng phương pháp đo phổ hấp thụ cực tím trong TCVN\r\n6604:2000 (ISO 4052:1983). Cà phê - Xác định hàm lượng caphein (phương pháp\r\nchuẩn).

2. Tiêu chuẩn\r\ntrích dẫn

TCVN 6536:1999 (ISO 1447:1978) Cà\r\nphê nhân - Xác định độ ẩm (phương pháp thông thường)

TCVN 5567:1991 (ISO 3726:1983)\r\nCàphê tan - Xác định khối lượng hao hụt ở 70^oC dưới áp suất thấp.

ISO 6673:1983 Càphê nhân - Xác định\r\nkhối lượng hao hụt ở 105 ^oC.

3. Nguyên tắc

Chiết caphêin từ phần mẫu thử bằng\r\nnước ở 90 ^oC với sự có mặt của magiê oxit. Lọc và sau đó tinh chế\r\nphần chất lỏng trên vi cột silic đioxyt đã được cải biến bằng các nhóm phenyl.

Sắc ký lỏng cao áp để xác định hàm\r\nlượng caphêin bằng phát hiện tia tử ngoại.

4. Thuốc thử

Nếu không có qui định khác, chỉ\r\nđược dùng các thuốc thử thuộc loại phân tích, và nước cất hoặc nước đã khử\r\nkhoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

4.1. Metanol, loại dùng cho\r\nHPLC.

4.2. Dung dịch amoniac (0,3\r\nmol/l) metanol, hỗn hợp tỷ lệ 90 + 10 theo thể tích.

4.3. Dung môi rửa giải, dùng\r\ncho cột tinh chế, hỗn hợp metanol/ nước/ axit axêtic tỷ lệ 75 + 25 + 1 theo thể\r\ntích.

4.4. Pha động, hỗn hợp\r\nmetanol/ nước, tỷ lệ 30 + 70 theo thể tích.

Cho 600 ml metanol (4.1) vào bình\r\nđịnh mức dung tích 2 lít và cho nước vào đến vạch. Trộn kỹ sau đó lọc hỗn hợp\r\nqua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 mm\r\n(5.7).

Chú thích 2 - Bằng cách điều chỉnh\r\nnồng độ metanol có thể thay đổi thời gian lưu giữ của caphêin sao cho đạt được\r\nsự chia tách tối ưu trong HPLC.

4.5. Etanol/ nước, dung dịch\r\ntỷ lệ 1 + 4 theo thể tích.

4.6. Oxit magie

4.7. Caphêin, dung dịch gốc, tương\r\nứng với 0,5 g caphêin trong một lít.

Cân, chính xác tới 0,1 mg, 125 mg caphêin\r\ncho vào bình thủy tinh màu hổ phách thể tích 250 ml của cùng hỗn hợp etanol/\r\nnước. Cho thêm etanol / nước (4.5) đủ đến nửa bình. Hòa tan hết caphêin và sau\r\nđó thêm đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản được\r\n1 tháng trong tủ lạnh.

4.8. Caphêin, các dung dịch\r\nchuẩn.

4.8.1. Dung dịch chuẩn A, tương\r\nứng với 0,010 g caphêin trên lít, để dùng cho các sản phẩm đã được loại\r\ncaphêin.

Để cho dung dịch gốc (4,7) ấm lên\r\nđến nhiệt độ phòng. Dùng pipet (5.12) lấy 2 ml dung dịch gốc này cho vào bình\r\nthể tích 100 ml một vạch. Cho nước đầy đến vạch và trộn.

Pha dung dịch này trong ngày sử\r\ndụng.

4.8.2. Dung dịch chuẩn B, tương\r\nướng với 0,05 g caphêin trong lít, để dùng cho các sản phẩm thông thường.

Để cho dung dịch gốc (4,7) ấm lên\r\nđến nhiệt độ phòng. Dùng pipet (5.12) lấy 5 ml dung dịch gốc này cho vào bình\r\nđịnh mức dung tích 100 ml. Cho nước đầy đến vạch và trộn.

5. Thiết bị,\r\ndụng cụ

Sử dụng các thiết bị thí nghiệm\r\nthông thường và đặc biệt là các dụng cụ sau:

5.1. Máy sắc ký lỏng cao áp, có\r\ntrang bị detector cực tím, cho phép đo trong vùng bước sóng từ 254 nm đến 280\r\nnm, và có trang bị máy ghi. Bước sóng càng gần với 280 nm là tốt bởi vì pic hấp\r\nthụ cực đại của caphêin ở 272 nm.

5.2. Cột sắc ký để chạy HPLC, loại\r\nC₁₈, tốt nhất là được nhồi bằng các hạt hình cầu rỗng và có ít nhất\r\nđủ 5000 đĩa lý thuyết.

Số đĩa lý thuyết N của cột có thể\r\nđược tính như sau theo hình dạng của các pic thu được bằng bơm dung dịch\r\ncaphêin chuẩn tinh khiết (4.8).

trong đó

t là thời gian lưu giữ của pic;

w_0,5 là độ rộng pic tại\r\ngiữa đường cao của pic.

5.3. Cột tinh chế, để chạy\r\nsắc ký pha ngược, dung tích 3 ml, được nhồi bằng silica được cải biên bằng các\r\nnhóm phenyl, kích thước trung bình của các hạt là 40 mm.

5.4. Máy xay cà phê, thích\r\nhợp để xay hạt cà phê đã rang.

5.5. Máy nghiền cà phê có\r\nbánh răng và vỏ làm mát hoặc máy nghiền phân tích có lưỡi cắt và vỏ làm mát,\r\nhoặc các loại máy nghiền khác thích hợp để nghiền hạt cà phê nhân.

5.6. Bộ rây thí nghiệm, đan\r\nbằng lưới kim loại kích thước mắt rây là 630 mm.

5.7. Bộ lọc, kích thước lỗ\r\nlà 0,45 mm.

5.8. Nồi cách thủy, có khả\r\nnăng điều chỉnh nhiệt độ ở 90 ^oC ±\r\n1 ^oC và khuấy được liên tục.

5.9. Cân phân tích, có thể\r\ncân chính xác tới 0,000 1 g.

5.10. Chai, dung tích 250 ml\r\ncó nắp vặn xoáy

5.11. Bình định mức 1 vạch, dung\r\ntích 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml và 2 lít.

5.12. Pipet, dung tích 2,0\r\nml; 5,0 ml và 10,0 ml.

6. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu cà phê nhân đóng trong\r\nbao được tiến hành theo TCVN 6539:1999 (ISO 4072:1982).

Việc lấy mẫu cà phê tan đựng trong\r\nthùng có lớp lót được tiến hành theo TCVN 6605:2000 (ISO 6670:1983).

7. Chuẩn bị mẫu\r\nthử

Nếu cần thiết phải nghiền mẫu bằng\r\ndụng cụ thích hợp được qui định trong 5.4 hoặc 5.5 cho đến khi mẫu lọt được qua\r\nrây (5.6).

8. Cách tiến\r\nhành

8.1. Xác định hàm lượng chất khô

Tính hàm lượng chất khô từ hàm\r\nlượng nước xác định được trong 1 phần của mẫu thử (điều 7) theo:

- TCVN 6536:1999 (ISO 1447) hoặc\r\nISO 6673 đối với cà phê nhân;

- ISO 3727 đối với cà phê tan,\r\nhoặc;

- theo các tiêu chuẩn khác áp dụng\r\ncho cà phê và cho các sản phẩm khác chế biến từ cà phê.

8.2. Phần mẫu thử

8.2.1. Cà phê nhân hoặc rang\r\nthông thường và đã loại caphêin

Cân lấy 1 g mẫu thử (điều 7) chính\r\nxác tới 0,0001g.

8.2.2. Bột cà phê chiết\r\nthông thường và đã loại caphêin

Cân lấy 0,5 g mẫu thử (điều 7)\r\nchính xác tới 0,0001g.

8.3. Chiết chất caphêin

8.3.1. Cho phần mẫu thử\r\n(8.2.1) hoặc (8.2.2) vào chai dung tích 250 ml (5.10). Thêm 4 g ± 0,5 g oxit magie (4.6) và 100 g nước. Cân\r\nchai cùng các chất đựng bên trong, chính xác tới 0,1 g.

8.3.2. Đóng nắp chai và trộn\r\nkỹ các chất trong chai. Đặt chai đã chứa các chất vào nồi cách thủy (5.8) và\r\nđun nóng đến 90 ^oC đồng thời khuấy liên tục trong vòng 20 phút.

Để nguội chai cùng các chất chứa\r\nbên trong và cân lại chính xác đến 0,1 g. Khối lượng của chai nguội cùng các\r\nchất đựng bên trong phải bằng khối lượng xác định được trong 8.3.1.

8.3.3. Nếu khối lượng của 2\r\nlần cân khác nhau, thực hiện chiết khác (8.3.1 và 8.3.2) sử dụng phần mẫu thử\r\nkhác.

8.3.4. Để cho dung dịch\r\ntĩnh. Lọc dung dịch qua bộ lọc (5.7).

8.4. Tinh chế dung dịch

Trước mỗi lần chiết tách dung dịch,\r\nhoạt hóa cột tinh chế (5.3).

8.4.1. Chuẩn bị cột tinh chế

Lắp cột tinh chế như vẽ trên hình\r\n1.

Hình\r\n1 - Chuẩn bị cột tinh chế

Mở van khóa và rửa cột bằng 5 ml\r\nmetanol (4.1), điều chỉnh van khóa để cho metanol chảy từng giọt. Khi còn lại\r\nkhoảng 1 mm đến 2 mm metanol ở phía trên bề mặt silica thì đóng van. Cho thêm 5\r\nml nước, mở van và khi nào còn 1 mm đến 2 mm nước ở phía trên bề mặt silica thì\r\nlại đóng van.

Không để cho cột bị khô, nếu không,\r\nphải tiến hành chuẩn bị lại.

8.4.2. Hấp thụ caphêin

Dùng pipet để đưa vào cột, hoặc:

a) 2,0 ml dung dịch đã lọc thu được\r\ntrong 8.3.3 trong trường hợp là cà phê thường hoặc cà phê chiết, hoặc

b) 10,0 ml dung dịch đã lọc thu\r\nđược trong 8.3.4 trong trường hợp là cà phê đã khử caphêin hoặc cà phê chiết đã\r\nkhử caphêin.

Điều chỉnh van để cho dung dịch\r\nchảy từng giọt. Khi bề mặt của dung dịch hạ thấp xuống ngay dưới bề mặt của\r\nsilica thì đóng van.

8.4.3. Khử những thành phần\r\nkhông cần thiết

Mở van khóa và cho 2,5 ml hỗn hợp\r\ndung dịch amoniac/metanol (4.2). Đóng van khi bề mặt của hỗn hợp hạ thấp ngay\r\nsát dưới bề mặt của silica. Cho thêm tiếp 2,5 ml hỗn hợp (4.2) nữa và để hỗn\r\nhợp chảy hết khỏi cột. Thổi khoảng 20 ml không khí qua cột để khử tối đa hỗn\r\nhợp (4.2)

Chú thích 3 - Ở giai đoạn này của\r\nquy trình cột có thể bị khô.

8.4.4. Rửa giải caphêin

Đặt 1 bình định mức dung tích 10 ml\r\nmột vạch (5.11) phía dưới cột. Mở van và cho 7,5 ml dung môi rửa giải (4.3),\r\nđiều chỉnh van để cho dung môi chảy từng giọt. Để cho dung môi rửa giải chảy\r\nhết vào bình. Cho nước vào đến vạch và trộn kỹ.

Chú thích 4 - Cột tinh chế có thể\r\nđược tái sinh bằng metanol như qui định 8.4.1. Có thể sử dụng đến 10 lần cho\r\nmục đích tinh chế.

8.5. Phân tích bằng HPLC

8.5.1. Hiệu chỉnh thiết bị.

Bật máy sắc ký (5.1) và hiệu chỉnh\r\nmáy như sau:

- Tốc độ dòng chảy của pha động\r\n(4.4): từ 0,5 ml/ phút đến 1,5 ml/ phút tùy theo loại cột được dùng (xem 5.2)

- Nhiệt độ của cột (5.2): 40 ^oC

Chú thích 5 - Có thể tăng pic tách\r\nbằng cách tăng nhiệt độ của cột nhưng không được quá 60 ^oC.

8.5.2. Phân tích

Khi tốc độ dòng chảy của pha động\r\n(4.4) và nhiệt độ ổn định, bơm vào cột 10 ml\r\ndung dịch mẫu thử thu được trong 8.4.4 và sau đó bơm một thể tích như vậy dung\r\ndịch caphêin chuẩn (4.8.1 hoặc 4.8.2).

Chú thích 6 - Trong qui trình bình\r\nthường, định luật Beer được tuân thủ với nồng độ chất caphêin tới 0,0250g/ l.\r\nMức này có cao hơn so với nồng độ caphêin áp dụng trong phương pháp thử này.\r\nTuy nhiên, nếu điều này không phải do sai lệch của thiết bị, vẫn phải xây dựng\r\nđường hiệu chuẩn các nồng độ caphêin.

9. Tính và biểu\r\nthị kết quả

Hàm lượng caphêin trong mẫu được\r\nbiểu thị bằng gam trên 100 g chất khô như sau:

9.1. Đối với cà phê nhân\r\nsống hoặc đã rang và bột cà phê tan:

trong đó

A_x là diện tích pic\r\ncaphêin thu được với dung dịch mẫu thử;

A_c là diện tích pic\r\ncaphêin thu được với dung dịch chuẩn;

c₁ là nồng độ của dung\r\ndịch caphêin chuẩn (8.4.2), tính bằng gam trên lit;

m₀ là khối lượng của\r\nphần mẫu thử, tính bằng gam;

RS là hàm lượng chất khô của mẫu,\r\ntính phần trăm theo khối lượng (xem 8.1).

9.2. Đối với cà phê nhân\r\nsống hoặc rang và bột cà phê đều đã khử caphêin:

trong đó

c₂ là nồng độ của dung\r\ndịch caphêin chuẩn (8.4.1), tính bằng gam trên lít;

10. Độ chính\r\nxác

10.1. Các kết quả thử của liên\r\nphòng thí nghiệm

Một thử nghiệm của liên phòng thí\r\nnghiệm đã tiến hành năm 1987 của ISO/TC 34/SC 15 cà phê, gồm 18 phòng thí\r\nnghiệm tham gia. Các giá trị về độ tái lập và độ lặp lại thu được trong bảng 1.\r\nPhương án lấy mẫu và quy trình thử tuân thủ phương án của liên thí nghiệm phù\r\nhợp với sự phân công được nếu trong ISO 5725.

Bảng\r\n1 - Độ lặp lại và độ tái lập

10.2 Độ lặp lại

Sự khác nhau tuyệt đối giữa hai kết\r\nquả thử độc lập, riêng rẽ thu được khi áp dụng một phương pháp, trên cùng một mẫu\r\nthử, tại một phòng thí nhgiệm, do một kỹ thuật viên thực hiện, dùng cùng một\r\nloại dụng cụ trong một khoảng ngắn thời gian phải không được vượt quá giá trị\r\nnêu trong bảng 1.

10.3 Độ tái lập

Sự khác nhau tuyệt đối giữa hai kết\r\nquả thử riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, trên cùng một mẫu\r\nthử, thực hiện ở các phòng thí nghiệm khác nhau, do các kỹ thuật viên khác nhau\r\ndùng dụng cụ khác nhau thực hiện phải không được vượt quá giá trị nêu trong\r\nbảng 1.

11. Báo cáo\r\nkết quả

Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương\r\npháp sử dụng và kết quả thu được. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao\r\ntác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi\r\ntiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả

Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả\r\ncác thông tin cần thiết về việc nhận biết hoàn toàn mẫu thử.

PHỤ LỤC A

(Tài\r\nliệu tham khảo)

THƯ\r\nMỤC

1. TCVN 6539:1999 (ISO 4072:1982),\r\nCà phê nhân đóng bao - Lấy mẫu.

2. ISO 5725:1986, Độ chính xác của\r\nphương pháp thử - Xác định độ lặp lại và độ tái lập cho phương pháp thử chuẩn\r\nbởi liên phòng thí nghiệm.

3. TCVN 6605:2000 (ISO 6670:1983),\r\nCà phê tan đựng trong thùng có lót - Lấy mẫu.