\r\nShampoo
Tiêu chuẩn này áp dụng cho nước gội đầu tổng\r\nhợp dùng nguyên liệu là những chất hoạt động bề mặt dễ bị phân huỷ sinh học và\r\nmột số phụ gia khác được bộ Y Tế cho phép sử dụng trong mỹ phẩm.
\r\n\r\n\r\n\r\nTCVN 1056 - 86 Thuốc thử. Phương pháp chuẩn\r\nbị các thuốc thử dung dịch và hỗn hợp phụ dùng trong phân tích trắc quang và\r\nphân tích đục khuyếch tán.
\r\n\r\nTCVN 3778 - 82 Thuốc thử. Phương pháp\r\nxác định asen.
\r\n\r\nTCVN 4851 - 89 (ISO 3696-1987) Nước dùng để\r\nphân tích trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
\r\n\r\nTCVN 5454 :1999 (ISO 607-1980) Chất hoạt động\r\nbề mặt và chất tẩy rửa Phương pháp phân chia mẫu.
\r\n\r\nTCVN 5456 - 91 Chất tẩy rửa tổng hợp. Phương\r\npháp xác định chỉ số nồng độ ion hidro (độ pH).
\r\n\r\nTCVN 5491 - 91 (ISO 8212-1986) Chất hoạt động\r\nbề mặt và chất tẩy rửa. Lấy mẫu trong sản xuất. Tiêu chuẩn giới hạn vi khuẩn,\r\nnấm mốc và phương pháp thử của bộ Y Tế quy định cho mỹ phẩm số 3113/1999/QĐ-BYT\r\nngày 11/10/1999.
\r\n\r\nTiêu chuẩn độ kích ứng da và phương pháp thử của\r\nbộ Y Tế quy định cho mỹ phẩm số 3113/1999/QĐ-BYT ngày 11/10/1999.
\r\n\r\n\r\n\r\nYêu cầu kỹ thuật của nước gội đầu phải phù\r\nhợp với các quy định trong bảng 1 và bảng 2.
\r\n\r\nBảng 1 - Các chỉ tiêu ngoại quan
\r\n\r\n| \r\n Tên chỉ tiêu \r\n | \r\n \r\n Yêu cầu \r\n | \r\n
| \r\n 1. Trạng thái \r\n2. Mầu \r\n3. Mùi \r\n | \r\n \r\n Lỏng sánh, đồng nhất, không tách lớp, phân\r\n tầng và kết tủa khi biến đổi nhiệt độ nhỏ hơn 10 0C và lớn hơn 45 0C \r\nĐồng nhất \r\nDễ chịu, đặc trưng cho từng sản phẩm \r\n | \r\n
\r\n\r\n
Bảng 2 - Các chỉ tiêu chất lượng
\r\n\r\n\r\n\r\n
| \r\n Tên chỉ tiêu \r\n | \r\n \r\n Mức chất lượng \r\n | \r\n
| \r\n 1. Hàm lượng chất hoạt động bề mặt , tính\r\n bằng phần trăm khối lượng, không nhỏ hơn. \r\n | \r\n \r\n 10 \r\n | \r\n
| \r\n 2. pH của dung dịch 1% \r\n | \r\n \r\n 4 - 8 \r\n | \r\n
| \r\n 3. Hàm lượng asen tính bằng mg/kg , không\r\n lớn hơn \r\n | \r\n \r\n 1 \r\n | \r\n
| \r\n 4. Hàm lượng kim loại nặng, tính theo chì,\r\n bằng mg/kg , không lớn hơn \r\n | \r\n \r\n 2 \r\n | \r\n
| \r\n 5. Độ kích ứng da \r\n | \r\n \r\n Không đáng kể \r\n | \r\n
| \r\n 6. Vi khuẩn và nấm mốc \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 6.1. Vi khuẩn staphylococcus aureus,\r\n candida albicans và pseudomonas aeruginosa \r\n | \r\n \r\n Không được phép \r\n | \r\n
| \r\n 6.2. Tổng số nấm mốc sống lại được, tính\r\n bằng số lượng trong một gam mẫu, không được lớn hơn \r\n | \r\n \r\n 100 \r\n | \r\n
| \r\n 6.3. Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại\r\n được, tính bằng số lượng trong một gam mẫu, không được lớn hơn \r\n | \r\n \r\n 1000 \r\n | \r\n
| \r\n 6.4. Tổng số Enterobacteria và các vi khuẩn\r\n Gram âm khác, tính bằng số lượng trong một gam mẫu, không được lớn hơn \r\n | \r\n \r\n 10 \r\n | \r\n
| \r\n 7.Độ phân huỷ sinh học, tính bằng phần trăm\r\n khối lượng, không nhỏ hơn \r\n | \r\n \r\n 90 \r\n | \r\n
4.1 Quy định chung
\r\n\r\nHoá chất dùng để phân tích là loại TKPT hoặc\r\nTKHH
\r\n\r\nNước cất sử dụng theo TCVN 4851 - 89 (ISO\r\n3696-1987);
\r\n\r\nCân phân tích, có độ chính xác tối thiểu\r\n0,001g.
\r\n\r\n4.2 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
\r\n\r\nLấy mẫu và chuẩn bị mẫu theo TCVN 5454 : 1999\r\nvà TCVN 5491 : 1991 với lượng mẫu trung bình tối thiểu là 1000 g.
\r\n\r\nMẫu thí nghiệm được cho vào bình sạch, khô,\r\ncó nút kín, ngoài bình có nhãn ghi:
\r\n\r\n– tên chất tẩy rửa;
\r\n\r\n– tên nơi sản xuất;
\r\n\r\n– ngày sản xuất;
\r\n\r\n– ngày và nơi lấy mẫu;
\r\n\r\n4.3 Đánh giá ngoại quan sản phẩm
\r\n\r\nLấy khoảng 200 g mẫu vào cốc thuỷ tinh 500\r\nml. Dùng mắt để quan sát mẫu, cần tiến hành ở nơi có đủ ánh sáng, tránh ánh\r\nsáng trực tiếp, không có mầu sắc khác ở gần và không có mùi lạ. Quan sát các đặc\r\ntính sau:
\r\n\r\nTrạng thái: Mô tả trạng thái quan sát được,\r\nđặc biệt lưu ý về tính đồng nhất của sản phẩm.
\r\n\r\nMầu sắc: Mô tả mầu sắc quan sát được.
\r\n\r\nMùi: Mô tả mùi cảm nhận được.
\r\n\r\nThử mẫu ở nhiệt độ nhỏ hơn 10 0C : Lấy khoảng\r\n200 g mẫu vào cốc thuỷ tinh dung tích 250 ml và đặt ở bình ổn nhiệt 10 0C. Sau\r\n24 giờ mẫu đạt ở nhiệt độ này, lấy ra quan sát.
\r\n\r\nThử mẫu ở nhiệt độ lớn hơn 45 0C : Lấy khoảng\r\n200 g mẫu vào cốc thuỷ tinh dung tích 250 ml và đặt ở bình ổn nhiệt 45 0C. Sau\r\n24 giờ mẫu đạt ở nhiệt độ này, lấy ra quan sát.
\r\n\r\nĐánh giá mẫu thử theo các yêu cầu qui định ở\r\nđiều 3 bảng 1.
\r\n\r\n4.4 Xác định hàm lượng chất hoạt động bề mặt
\r\n\r\n4.4.1 Nguyên tắc
\r\n\r\nCác chất hoạt động bề mặt được tách khỏi nước\r\ngội đầu bằng etanol và được tính sau khi trừ đi những thành phần khác cũng tan\r\ntrong etanol như clorua, glyxerin.
\r\n\r\nChuẩn độ muối clorua (tính ra NaCl) bằng bạc\r\nnitrat với chỉ thị mầu kali cromat.
\r\n\r\nDựa vào phản ứng oxy hoá khử của glyxerin với\r\nkali periodat trong môi trường axit, lượng periodat dư tác dụng với kali iodua\r\ngiải phóng iot. Định lượng iot mới sinh bằng chuẩn độ với natri thiosunfat và\r\ntính ra hàm lượng glyxerin.
\r\n\r\n4.4.2 Hoá chất và thuốc thử
\r\n\r\n– etanol 990;
\r\n\r\n– bạc nitrat, dung dịch 0,1 N;
\r\n\r\n– kali cromat, dung dịch 10 %;
\r\n\r\n– axit nitric, dung dịch 1 : 4;
\r\n\r\n– methyl đỏ, dung dịch 0,1 % pha trong\r\netanol;
\r\n\r\n– axit clohidric, d = 1,19 và dung dịch 1 +\r\n1;
\r\n\r\n– natri thiosunfat, dung dịch 0,1 N;
\r\n\r\n– kali periodat, dung dịch 0,1 N;
\r\n\r\n– kali iodua, dung dịch 10 %;
\r\n\r\n– hồ tinh bột, dung dịch 1 %.
\r\n\r\n4.4.3 Thiết bị và dụng cụ:
\r\n\r\n– tủ sấy duy trì ở nhiệt độ 105 0C 2 0C;
\r\n\r\n– bếp cách thuỷ;
\r\n\r\n– bình tam giác dung tích 100 ml;
\r\n\r\n– bình tam giác có nút nhám, dung tích 250\r\nml;
\r\n\r\n– cốc thuỷ tinh, dung tích 250 ml;
\r\n\r\n– buret 25 ml.
\r\n\r\n4.4.4 Cách tiến hành
\r\n\r\n4.4.4.1 Xác định tổng hàm lượng chất tan\r\ntrong etanol
\r\n\r\nCân khoảng 5 g mẫu (chính xác đến 0,001 g)\r\nvào cốc thuỷ tinh dung tích 250 ml, thêm vào đó 40 ml etanol. Đậy cốc bằng mặt\r\nkính đồng hồ, đun nóng trên bếp cách thuỷ và khuấy cho mẫu phân tán hoàn toàn.\r\nLọc mẫu qua giấy lọc vào bình tam giác dung tích 100 ml đã được sấy khô và cân trước\r\nđến khối lượng không đổi m0 (chính xác đến 0,001 g).
\r\n\r\nTiếp tục quá trình hoà tan trên hai lần nữa,\r\nmỗi lần với 20 ml etanol. Thu gộp tất cả dung dịch lọc vào bình tam giác trên\r\nvà cô nhẹ bình này trên bếp cách thuỷ cho đến khi chỉ còn lại cặn. Sấy bình tam\r\ngiác này ở nhiệt độ 105 0C đến khối lượng không đổi. Để nguội bình trong bình\r\nhút ẩm, sau
\r\n30 phút đem cân là giá trị m1 (chính xác đến 0,001 g).
4.4.4.2 Xác định hàm lượng muối clorua tan\r\ntrong etanol
\r\n\r\nHoà tan phần cặn sau khi xác định chất tan\r\ntrong etanol ở điều 4.4.4.1 trong 20 ml nước cất và thêm hai giọt methyl đỏ,\r\nnếu dung dịch có mầu vàng thì trung hoà bằng dung dịch axit nitric 1 + 4 đến\r\nmầu hồng. Cho vào 2,5 ml dung dịch kali cromat 10 %. Chuẩn độ bằng dung dịch\r\nbạc nitrat 0,1 N đến khi xuất hiện mầu đỏ gạch, thể tích chuẩn độ là V1. Đồng\r\nthời tiến hành thí nghiệm mẫu trắng với tất cả các thuốc thử nhưng không có\r\nmẫu, thể tích chuẩn độ là V0.
\r\n\r\n4.4.4.3 Xác định hàm lượng glyxerin tan trong\r\netanol
\r\n\r\nHoà tan phần cặn sau khi xác định chất tan trong\r\netanol ở điều 4.4.4.1 trong khoảng 25 ml nước và thêm 5 ml dung dịch HCl (1 +\r\n1), chuyển dung dịch vào bình tam giác có nút nhám dung tích 250 ml, thêm chính\r\nxác 25 ml dung dịch kali periodat, đậy nút, lắc đều mẫu, để yên 15 phút. Lấy\r\nmẫu ra, cho thêm 20 ml dung dịch axit clohidric (1 + 1) và 20 ml dung dịch kali\r\niodua. Đậy nút, lắc tròn, để yên trong bóng tối 5 phút. Sau đó chuẩn độ dung\r\ndịch bằng dung dịch natri thiosunfat đến mầu vàng nhạt, thêm vào đó 1 ml dung\r\ndịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ đến khi mất mầu xanh của dung dịch, thể\r\ntích dung dịch chuẩn độ là V2 ml. Đồng thời tiến hành thí nghiệm mẫu trắng với\r\ntất cả các thuốc thử nhưng không có mẫu, thể tích dung dịch chuẩn độ là V3 ml.
\r\n4.4.5 Tính kết quả
4.4.5.1 Tổng hàm lượng chất tan trong etanol
\r\n\r\nTổng hàm lượng chất tan trong etanol (X1),\r\ntính bằng phần trăm khối lượng, theo công thức sau:
\r\n\r\n![](\"00900416_files/image001.gif\")
trong đó
\r\n\r\nm0 - khối lượng của bình, tính bằng gam;
\r\n\r\nm1 - khối lượng của cặn và bình, tính bằng\r\ngam;
\r\n\r\nm - khối lượng mẫu thử, tính bằng gam.
\r\n\r\n4.4.5.2 Hàm lượng muối clorua tan trong\r\netanol
\r\n\r\nHàm lượng muối clorua tan trong etanol (X2),\r\nquy ra NaCl, bằng phần trăm khối lượng (%), theo công thức sau:
\r\n\r\n![](\"00900416_files/image002.gif\")
trong đó
\r\n\r\nV1 - thể tích bạc nitrat 0,1 N dùng để chuẩn\r\nđộ mẫu thử, tính bằng mililít;
\r\n\r\nV0 - thể tích bạc nitrat 0,1 N dùng để chuẩn\r\nđộ mẫu trắng, tính bằng mililít;
\r\n\r\nm - khối lượng mẫu thử, tính bằng gam;
\r\n\r\n0,0058 - lượng gam natri clorua tương ứng 1\r\nml bạc nitrat 0,1 N.
\r\n\r\n4.4.5.3 Hàm lượng glyxerin tan trong etanol
\r\n\r\nHàm lượng glyxerin tan trong etanol (X3),\r\ntính bằng phần trăm khối lượng (%), theo công thức sau:
\r\n\r\n![](\"00900416_files/image003.gif\")
trong đó
\r\n\r\nV2 - thể tích natri thiosunfat 0,1 N dùng để\r\nchuẩn độ mẫu thử, tính bằng mililít;
\r\n\r\nV3 - thể tích natri thiosunfat 0,1 N dùng để\r\nchuẩn độ mẫu trắng, tính bằng mililít;
\r\n\r\nm - khối lượng mẫu thử, tính bằng gam;
\r\n\r\n0,0023 - lượng gam glyxerin tương ứng 1 ml\r\nnatri thiosunfat 0,1 N.
\r\n\r\n4.4.5.4 Tổng hàm lượng chất hoạt động bề mặt\r\ntan trong etanol
\r\n\r\nTổng hàm lượng chất hoạt động bề mặt tan\r\ntrong etanol (X), tính bằng phần trăm khối lượng (%) theo công thức sau
\r\n\r\ntrong đó
\r\n\r\nX1 - tổng hàm lượng chất tan trong etanol,\r\ntính bằng %;
\r\n\r\nX2 - hàm lượng muối natri clorua tan trong\r\netanol, tính bằng %;
\r\n\r\nX3 - hàm lượng glyxerin, tính bằng %.
\r\n\r\n4.4.6 Độ chính xác của phương pháp
\r\n\r\n4.4.6.1 Độ lặp lại
\r\n\r\nChênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả xác\r\nđịnh song song tiến hành trên cùng một mẫu thử hoặc được thực hiện liên tiếp,\r\ndo cùng một người phân tích, sử dụng cùng loại thiết bị không được vượt quá 0,3\r\n% chất hoạt động bề mặt.
\r\n\r\n4.4.6.2 Độ tái lặp
\r\n\r\nChênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thu\r\nđược trên cùng một mẫu thử ở hai phòng thí nghiệm không được vượt quá 0,5 %\r\nchất hoạt động bề mặt.
\r\n\r\n4.5 Xác định độ pH
\r\n\r\nThực hiện theo TCVN 5456 - 91 Chất tẩy rửa\r\ntổng hợp. Phương pháp xác định chỉ số nồng độ ion hidro (độ pH).
\r\n\r\n4.6 Xác định hàm lượng asen và kim loại nặng
\r\n\r\n4.6.1 Chuẩn bị dung dịch thử
\r\n\r\nCân khoảng 10 g mẫu (chính xác đến 0,01 g)\r\nvào bình tam giác chịu nhiệt dung tích 250 ml. Thêm 10 ml axit sunfuric đặc và\r\nđun nhẹ trên bếp điện, sau đó tăng dần nhiệt độ để mẫu cháy thành dung dịch\r\nsánh mầu nâu đen. Để nguội dung dịch và thêm dần từng giọt khoảng 5 ml axit\r\nnitric đặc và tiếp tục đun sôi nhẹ đến khi dung dịch trở thành trong suốt. Để\r\nnguội dung dịch và tráng thành bình bằng khoảng 20 ml nước cất, thêm 5 ml dung\r\ndịch axit axetic 30 %, đun sôi lại dung dịch một lần nữa. Dung dịch trong bình\r\ntrong suốt, không mầu là đạt. Để nguội chuyển dung dịch vào bình định mức dung\r\ntích 100 ml, định mức đến vạch và lắc kỹ. Dung dịch này dùng để xác định asen\r\nvà kim loại nặng.
\r\n\r\n4.6.2 Xác định hàm lượng kim loại nặng, tính\r\ntheo chì.
\r\n\r\n4.6.2.1 Nguyên tắc
\r\n\r\nCác ion kim loại nặng tạo với dung dịch natri\r\nsunfua kết tủa mầu đen hay nâu trong môi trường axit axetic pH= 3,5 - 4. So\r\nsánh mầu của dung dịch mẫu với mầu của dung dịch chuẩn chì.
\r\n\r\n4.6.2.2 Hoá chất và thuốc thử:
\r\n\r\n– axit sunfuric, d = 1,84;
\r\n\r\n– axit clohidric, d = 1,19;
\r\n\r\n– axit nitric, d = 14,3;
\r\n\r\n– axit axetic, dung dịch 30 % và (1 + 15);
\r\n\r\n– natri sunfua, dung dịch 2 %;
\r\n\r\n– amoniac, dung dịch 25 % và (1 + 2);
\r\n\r\n– dung dịch chì tiêu chuẩn A,1 mg/ml, chuẩn\r\nbị theo TCVN1056 - 86;
\r\n\r\n– dung dịch chì tiêu chuẩn B, 0,010 mg/ml,\r\nlấy 10 ml dung dịch A cho vào bình định mức
\r\n1000 ml, định mức tới vạch bằng nước và lắc kỹ;
– dung dịch chì tiêu chuẩn C, 0,0001 mg/ml,\r\nlấy 10 ml dung dịch B cho vào bình định mức 1000 ml, định mức tới vạch bằng\r\nnước và lắc kỹ;
\r\n\r\n– Dung dịch B và C chỉ pha trước khi dùng.
\r\n\r\n4.6.2.3 Dụng cụ:
\r\n\r\n– ống so mầu Nessler 50 ml;
\r\n\r\n– bình định mức dung tích 100 ml, 1000 ml.
\r\n\r\n4.6.2.4 Cách tiến hành
\r\n\r\nHút 10 ml dung dịch mẫu ở điều 4.6.1 vào ống\r\nso mầu Nessler. Đồng thời lấy 20 ml dung dịch tiêu chuẩn chì C vào ống so mầu\r\nkhác. Trung hoà dung dịch mẫu và dung dịch tiêu chuẩn bằng dung dịch amoniac (1\r\n+ 2) theo chỉ thị phenolphtalein đến phớt hồng. Thêm vào mỗi ống thử 1 ml axit\r\naxetic và 0,5 ml dung dịch natri sunfua. Đậy nút và lắc đều. Sau 1 phút so sánh\r\nmầu của ống dung dịch thử không được đậm mầu hơn dung dịch của ống so sánh. Khi\r\nso sánh mầu phải nhìn từ trên xuống dưới, trên nền trắng.
\r\n\r\n4.6.3 Xác định hàm lượng asen
\r\n\r\n4.6.3.1 Nguyên tắc
\r\n\r\nLấy 10 ml dung dịch ở điều (4.6.1) và xác\r\nđịnh asen theo TCVN 3778 - 82 Thuốc thử. Phương pháp xác định asen. So sánh màu\r\ngiấy của mẫu với màu giấy của dung dịch tiêu chuẩn có 0,001 mg As.
\r\n\r\n4.7 Xác định mức độ kích ứng da
\r\n\r\nThử nghiệm trên da thỏ theo tiêu chuẩn độ\r\nkích ứng da của bộ Y Tế số 3113/1999/QĐ-BYT ngày11/10/1999. Xem phụ lục A và B.
\r\n\r\n4.8 Xác định giới hạn vi khuẩn và nấm mốc
\r\n\r\nTiêu chuẩn giới hạn vi khuẩn, nấm mốc trong\r\nmỹ phẩm của bộ Y Tế số 3113/1999/QĐ-BYT ngày11/10/1999. Xem phụ lục C.
\r\n\r\n\r\n\r\nBáo cáo kết quả xác định gồm những mục sau\r\nđây:
\r\n\r\n– tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết\r\nđầy đủ về mẫu thử;
\r\n\r\n– các phương pháp sử dụng (theo tiêu chuẩn\r\nnày);
\r\n\r\n– các kết quả thu được và cách biểu thị các\r\nkết quả;
\r\n\r\n– các chi tiết của mọi thao tác không qui\r\nđịnh trong tiêu chuẩn này hoặc các tiêu chuẩn khác, hoặc bất kỳ thao tác tuỳ ý\r\nnào cũng như các sự cố xẩy ra ảnh hưởng đến kết quả.
\r\n\r\n6.1 Bao gói
\r\n\r\nNước gội đầu được đóng trong các hộp bằng\r\nnhựa, hoặc chai thuỷ tinh hoặc bằng các vật liệu khác theo thoả thuận giữa nhà\r\nsản xuất và người tiêu thụ.
\r\n\r\nCác chai hoặc hộp nước gội đầu được xếp trong\r\nbao bì bằng các tông. Đảm bảo chắc chắn và an toàn trong quá trình vận chuyển\r\nvà bảo quản. Số lượng đóng gói theo thoả thuận giữa hai bên sản xuất và tiêu\r\nthụ.
\r\n\r\n6.2 Ghi nhãn
\r\n\r\nTrên mỗi chai hoặc hộp nước gội đầu có nhãn\r\nghi:
\r\n\r\n– tên hàng hoá;
\r\n\r\n– tên và địa chỉ cơ sở sản xuất;
\r\n\r\n– thành phần và hàm lượng nguyên liệu chính;
\r\n\r\n– dung tích thực;
\r\n\r\n– hướng dẫn sử dụng;
\r\n\r\n– ngày sản xuất và hạn sử dụng.
\r\n\r\nTrên mỗi thùng các tông có nhãn ghi:
\r\n\r\n– tên hàng hoá;
\r\n\r\n– tên và hàm lượng các nguyên liệu chính;
\r\n\r\n– tên và địa chỉ cơ sở sản xuất;
\r\n\r\n– số lượng chai, hộp;
\r\n\r\n– hướng dẫn bảo quản (ký hiệu che mưa nắng);
\r\n\r\n– hạn sử dụng.
\r\n\r\n6.3 Vận chuyển
\r\n\r\nVận chuyển bằng phương tiện thông dụng. Trong\r\nquá trình vận chuyển không được chồng xếp quá cao tránh gây đổ vỡ, bẹp bao bì\r\nsản phẩm và phải được che mưa nắng.
\r\n\r\n6.4 Bảo quản
\r\n\r\nBảo quản nước gội đầu trong kho khô mát.
\r\n\r\n
\r\n(Qui\r\nđịnh)
\r\nÁp\r\ndụng cho các sản phẩm dùng trong y tế và mỹ phẩm và ban hành kèm theo Quyết\r\nđịnh số 3113/1999/QĐ-BYT ngày 11 tháng 10 năm 1999 của Bộ trưởng Bộ Y tế)
A.1 Nguyên tắc
\r\n\r\nThử kích ứng trên da là một phương pháp sinh\r\nhọc dựa vào mức độ phản ứng của da thỏ với chất thử so với phần da kế bên không\r\nđắp chất thử.
\r\n\r\nPhép thử không áp dụng cho các chất axit hoặc\r\nkiềm mạnh (pH < 2 hoặc pH > 11,5) và các chất đã biết là có kích ứng trên\r\nda.
\r\n\r\nA.2 Dụng cụ thí nghiệm
\r\n\r\n– tông đơ điện hoặc một thiết bị thích hợp để\r\nlàm sạch lông thỏ;
\r\n\r\n– kéo, panh.
\r\n\r\nA.3 Động vật và điều kiện thí nghiệm
\r\n\r\nSử dụng thỏ trắng trưởng thành, đực hoặc cái\r\n(không sử dụng thỏ có chửa hoặc đang cho con bú), khoẻ mạnh, cân nặng không\r\ndưới 2 kg. Thỏ được nhốt riêng từng con và nuôi dưỡng trong điều kiện thí\r\nnghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thử.
\r\n\r\nThí nghiệm tiến hành trong nhiệt độ phòng 25\r\n0C 3 0C, độ ẩm tương đối 30 % - 70 %, ánh sáng bảo đảm 12 giờ tối, 12 giờ\r\nsáng hàng ngày.
\r\n\r\nA.4 Chuẩn bị mẫu thử
\r\n\r\nMẫu thử được chuẩn bị tuỳ theo tính chất và\r\ncách sử dụng trên người của từng loại sản phẩm.
\r\n\r\n– Chất lỏng: dùng trực tiếp hoặc pha loãng\r\nvới dung môi thích hợp.
\r\n\r\n– Chất rắn: có thể dùng trực tiếp hoặc tán\r\nthành bột ẩm với dung môi thích hợp để đảm bảo chất thử được tiếp xúc tốt với\r\nda.
\r\n\r\n– Với các chất rắn khác không thể tán thành\r\nbột, cần xử lý hoặc chiết xuất trước khi sử dụng (phương pháp chiết xuất nguyên\r\nliệu để thử sinh học được thực hiện theo hướng dẫn ở phụ lục A.1).
\r\n\r\n– Nếu sản phẩm cuối cùng ở dạng vô trùng,\r\nchất thử sẽ được tiệt trùng với cùng điều kiện như trong qui trình sản xuất.\r\nChú ý với sản phẩm tiệt trùng bằng etylen dioxit vì etylen dioxit và sản phẩm\r\nphân huỷ của nó có thể gây kích ứng. Cần có đánh giá đầy đủ những phản ứng của\r\nloại sản phẩm này trước và sau khi tiệt trùng.
\r\n\r\n– Dung môi dùng để pha loãng, làm ẩm hoặc\r\nchiết xuất là các chất phân cực (nước, nước muối sinh lý) hoặc không phân cực\r\n(dầu thực vật, dầu khoáng) không gây kích ứng.
\r\n\r\nA.5 Cách tiến hành
\r\n\r\nA.5.1 Chuẩn bị súc vật
\r\n\r\nTrước ngày thí nghiệm, làm sạch lông thỏ ở\r\nvùng lưng đều về hai bên cột sống một khoảng đủ rộng để đặt các mẫu thử và đối\r\nchứng (khoảng 10 cm x 15 cm). Chỉ những thỏ có da khoẻ mạnh, đồng đều và lành\r\nlặn mới được dùng vào thí nghiệm.
\r\n\r\nA.5.2 Đặt mẫu thử
\r\n\r\nMỗi mẫu được thử trên 3 thỏ. Liều chất thử\r\ntrên mỗi thỏ là 0,5 g hoặc 0,5 ml. Đặt mẫu thử đã chuẩn bị ở trên lên miếng gạc\r\nkhông gây kích ứng 2,5 cm x 2,5 cm có độ dày thích hợp rồi đắp lên da. Cố định\r\nmiếng gạc bằng băng dính không gây kích ứng ít nhất trong 4 giờ. Sau đó bỏ gạc\r\nvà băng dính, chất thử còn lại được làm sạch bằng dung môi thích hợp không gây\r\nkích ứng.
\r\n\r\nTrong trường hợp mẫu thử đã được pha loãng\r\nhoặc làm ẩm bằng dung môi, tiến hành song song đặt mẫu đối chứng là dung môi đã\r\ndùng ở chỗ da bên cạnh. Sơ đồ đặt mẫu thử có thể bố trí theo hình A.1.
\r\n\r\nHình A.1 - Sơ đồ đặt mẫu thử
\r\n\r\nA.6 Quan sát và ghi điểm
\r\n\r\nQuan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da đặt\r\nchất thử so với da kề bên không đặt chất thử ở các thời điểm 1 giờ, 24 giờ , 48\r\ngiờ và 72 giờ sau khi làm sạch mẫu thử. Có thể kéo dài hơn thời gian quan sát khi\r\ncó tổn thương sâu để có thể đánh giá đầy đủ hơn về khả năng hồi phục hoặc không\r\nhồi phục của vết thương nhưng không nên quá 14 ngày.
\r\n\r\nĐánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây\r\nban đỏ, phù nề theo qui định ở bảng A.1.
\r\n\r\n
\r\nBảng A.1 - Mức độ phản ứng trên da thỏ
| \r\n Phản ứng \r\n | \r\n \r\n Điểm đánh giá \r\n | \r\n
| \r\n Sự tạo vẩy và ban đỏ \r\n- Không ban đỏ \r\n- Ban đỏ rất nhẹ(vừa đủ nhận thấy) \r\n- Ban đỏ nhận thấy rõ \r\n- Ban đỏ vừa phải đến nặng \r\n- Ban đỏ nghiêm trọng (đỏ tấy) đến tạo\r\n thành vẩy dể ngăn ngừa sự tiến triển của ban đỏ \r\n\r\n | \r\n \r\n \r\n 0 \r\n1 \r\n2 \r\n3 \r\n4 \r\n | \r\n
| \r\n Gây phù nề \r\n- Không phù nề \r\n- Phù nề rất nhẹ (vừa đủ nhận thấy) \r\n- Phù nề nhận thấy rõ (viền phù nề phồng\r\n lên rõ) \r\n- Phù nề vừa phảI (da phồng lên khoảng 1\r\n mm) \r\n- Phù nề nghiêm trọng (da phồng lên trên 1\r\n mm và có lan rộng ra vùng xung quanh) \r\n- \r\n | \r\n \r\n \r\n 0 \r\n1 \r\n2 \r\n3 \r\n4 \r\n | \r\n
| \r\n Tổng số điểm kích ứng tối đa có thể \r\n | \r\n \r\n 8 \r\n | \r\n
\r\n\r\n
Những thay đổi khác trên da cần theo dõi và\r\nghi chép đầy đủ.
\r\n\r\nA.7 Đánh giá kết quả
\r\n\r\nTrên mỗi thỏ, điểm phản ứng được tính bằng\r\ntổng số điểm ở hai mức độ ban đỏ và phù nề chia cho số lần quan sát. Điểm kích\r\nứng của mẫu thử được lấy trung bình điểm phản ứng của các thỏ đã thử.
\r\n\r\nTrong trường hợp có dùng mẫu đối chứng, điểm\r\nphản ứng của mẫu thử được trừ đi số điểm của mẫu đối chứng.
\r\n\r\nChỉ sử dụng các điểm ở những thời gian quan\r\nsát ở 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ để tính kết quả.
\r\n\r\nĐối chiếu điểm kích ứng với các mức độ qui\r\nđịnh trên bảng A.2 để xác định khả năng gây kích ứng trên da thỏ của mẫu thử.
\r\n\r\nBảng A.2 - Phân loại các phản ứng thử trên da\r\nthỏ
\r\n\r\n| \r\n Loại phản ứng \r\n | \r\n \r\n Điểm trung bình \r\n | \r\n
| \r\n Kích ứng không đáng kể \r\n | \r\n \r\n Từ 0 đến 0,5 \r\n | \r\n
| \r\n Kích ứng nhẹ \r\n | \r\n \r\n lớn hơn 0,5 đến 2 \r\n | \r\n
| \r\n Kích ứng vừa phải \r\n | \r\n \r\n lớn hơn 2,0 đến 5,0 \r\n | \r\n
| \r\n Kích ứng nghiêm trọng \r\n | \r\n \r\n lớn hơn 5,0 đến 8,0 \r\n | \r\n
\r\n\r\n
A.8 Báo cáo kết quả
\r\n\r\nBáo cáo kết quả cần ghi đầy đủ các thông tin\r\nvề mẫu thử, súc vật thử (loài, số lượng). Ghi chi tiết cách chuẩn bị mẫu thử và\r\ncách đặt mẫu trên da, đIểm của các lần quan sát, những nhận xét thêm nếu có và\r\nđánh giá kết quả.
\r\n\r\nChú thích
\r\n\r\n Đánh giá mức độ kích ứng trên da không nên\r\nchỉ dựa vào số đIểm kích ứng mà còn căn cứ vào những mô tả sự thay đổi tình\r\ntrạng da đã quan sát được.
\r\n\r\n Việc kết luận mẫu thử đạt chất lượng về\r\nchỉ tiêu kích ứng da hay không phải phụ thuộc vào yêu cầu riêng của từng sản\r\nphẩm.
\r\n\r\n
\r\n(Qui\r\nđịnh)
\r\nAp\r\ndụng cho các sản phẩm dùng trong y tế và mỹ phẩm và ban hành kèm theo Quyết\r\nđịnh số 3113/1999/QĐ-BYT ngày 11 tháng 10 năm 1999 của Bộ trưởng Bộ Y tế)
B.1 Giới thiệu
\r\n\r\nĐể tiến hành đánh giá sinh học các nguyên vật\r\nliệu, cần phải dùng dạng dịch chiết với các môi trường thích hợp. Phụ lục này\r\ntrình bày một số phương pháp thông thường để thu được dịch chiết thử. Các phần\r\nbổ sung, không thay thế sẽ được ghi trong các chuyên luận riêng.
\r\n\r\nB.2 Dụng cụ
\r\n\r\n– nồi hấp có khả năng duy trì nhiệt độ 121 0C\r\n 2 0C;
\r\n\r\n– tủ sấy hoặc tủ ấm có khả năng duy trì nhiệt\r\nđộ 70 0C 2 0C; 50 0C 2 0C; 37 0C 2 0C;
\r\n\r\n– dụng cụ để cắt (kéo, dao, cưa). Làm sạch\r\ndụng cụ cắt bằng kim loại với một dung môI hữu cơ bay hơI như alcohol hoặc\r\naxeton. Không dùng các axit để làm sạch dụng cụ kim loại;
\r\n\r\n– pipet có kích thước phù hợp;
\r\n\r\n– cân chính xác đến 0,1 g;
\r\n\r\n– dụng cụ đo: thước đo mm, compa;
\r\n\r\n– bình chiết;
\r\n\r\n– môi trường chiết: sử dụng ít nhất một trong\r\nhai loại môi trường sau:
\r\n\r\n+ dung môi phân cực: nước muối sinh lý;
\r\n\r\n+ dung môi không phân cực: dầu thực vật (ví\r\ndụ dầu hạt bông, dầu vừng, đạt tiêu chuẩn EP hoặc USP) hoặc dầu khoáng trung\r\ntính.
\r\n\r\nCác môi trường chiết thích hợp khác với\r\nmôi trường trên như: ethanol/nước; ethanol/nước muối sinh lý; polyethylen\r\nglycol 400; dimethyl sulfocid; aceton, methanol, chloroform, chất diện hoạt pha\r\nloãng, dầu khoáng.
\r\n\r\nB.3 Chuẩn bị mẫu
\r\n\r\nB.3.1 Xác định diện tích bề mặt.
\r\n\r\n+ Đối với các mẫu được coi là đồng đều về mặt\r\nhình thể, dùng cách tính diện tích bề mặt theo công thức hình học.
\r\n\r\nNếu độ dày của nguyên liệu là dưới 0,5 mm,\r\ndung một mẫu với tổng diện tích bề mặt tương đương 120 cm2, chiết trong 20 ml\r\nmôi trường chiết, đảm bảo tất cả bề mặt của mẫu thử được tiếp xúc với môi\r\ntrường chiết.
\r\n\r\nNếu độ dày của nguyên liệu lớn hơn 0,5 mm,\r\nlấy mẫu thử với tổng diện tích bề mặt tương đương 60 cm2 chiết trong 20 ml môi\r\ntrường chiết, đảm bảo tất cả bề mặt của mẫu thử được tiếp xúc với môi trường chiết.
\r\n\r\n+ Đối với nguyên liệu có hình dạng không đồng\r\nđều, diện tích bề mặt không thể xác định được dễ dàng, dùng từ 2 - 4 g mẫu,\r\nchiết trong 20 ml môi trường chiết. Cân nguyên liệu có độ chính xác 0,1 g.
\r\n\r\n+ Các loại nguyên liệu khác.
\r\n\r\nĐối với các nguyên liệu mà môi trường chiết\r\nkhông đủ ngập hết diện tích bề mặt mẫu thử hoặc khối mẫu đã được chia nhỏ đông\r\nnhất (như bọt biển), dùng lượng mẫu lớn nhất mà thể tích môi trường chiết qui\r\nđịnh có thể bao phủ hết. Xác định tỷ lệ diện tích bề mặt sử dụng và cân khối\r\nlượng mẫu chính xác đến 0,1 g.
\r\n\r\n+ Các nguyên liệu không thể chia nhỏ được.
\r\n\r\nVới các nguyên liệu không thể chia nhỏ mà\r\nkhông làm mất đi đặc tính của mẫu, độ đồng nhất hoặc độ toàn vẹn của mẫu và thể\r\ntích môi trường chiết đã quy định không thể bao phủ toàn bộ mẫu (ví dụ các dụng\r\ncụ phức tạp, đồ vật kim loại, bên trong các túi), dùng một lượng tối thiểu môi\r\ntrường để có thể bao phủ hết bề mặt mẫu thử. Tuỳ thuộc vào loại nguyên liệu,\r\nđịnh rõ hoặc là khối lượng (chính xác đến 0,1 g) hoặc là diện tích bề mặt\r\n(chính xác đến 1 cm2) được chiết với thể tích dịch chiết qui định chính xác đến\r\n1 ml.
\r\n\r\nB.3.2 Chuẩn bị
\r\n\r\n3.2.1 Kiểm tra mẫu thử xem có bị nhiễm bẩn bề\r\nmặt, súc rửa và làm khô mẫu thử, chiết bằng nước tinh khiết hoặc nước để pha\r\ntiêm với tỷ lệ 70 ml/ 60 cm2 bề mặt. Súc rửa trong ít nhất 30 giây rồi gạn bỏ.\r\nSúc lại nếu cần, làm khô trước khi đem chiết.
\r\n\r\nChú ý: phần lớn các mẫu thử được cung cấp\r\ntrong đIều kiên vô trùng hoặc trong bao gói sạch. Việc thao tác bằng tay và\r\ntiếp xúc với nhiệt khô thường không đảm bảo trên thực tế, có thể ảnh hưởng\r\nkhông tốt đến kết quả của một số nghiên cứu. Có thể bỏ qua giai đoạn súc rửa\r\nvới các nguyên liệu sạch để nó có thể cho phép đánh giá một cách thực tế hơn\r\nnguyên liệu và quá trình sản xuất.
\r\n\r\n3.2.2 Chia nhỏ các nguyên liệu thành các mảnh\r\nnhỏ nếu có thể được.
\r\n\r\n3.2.3 Khi độ dày của nguyên liệu lớn hơn 1 mm\r\nvà không thể chia nhỏ được nữa, tính bề mặt tiếp xúc của tất cả các mảnh để xác\r\nđịnh lượng đem dùng.
\r\n\r\nB. 4 Qui trình chiết
\r\n\r\nB. 4.1 Cho nguyên liệu thử vào bình chiết có\r\nkích thước thích hợp. Đong thể tích môi trường chiết cần thiết (chính xác đến 1\r\nml) rồi đổ lên nguyên liệu thử trong bình. Trộn đều để đảm bảo các nguyên liệu\r\ntách rời, không dính vón lại với nhau.
\r\n\r\nB. 4.2 Nếu không có chỉ dẫn gì riêng, chiết\r\nmẫu thử ở 370 C trong 72 giờ. Khi tăng nhiệt độ chiết thì có thể giảm thời gian\r\nchiết theo các tỷ lệ điều chỉnh như sau:
\r\n\r\n1210 C trong 1 0,2 giờ
\r\n\r\n70 0C trong 24 2 giờ
\r\n\r\n50 0 C trong 72 2 giờ
\r\n\r\nB.4.3 Mẫu đối chứng: tiến hành như trên trong\r\ncùng điều kiện nhưng với dung môi và không có mẫu thử.
\r\n\r\nB.4.4 Sau khi chiết, khuấy và gạn dịch chiết\r\nsang bình sạch. Bảo quản dịch chiết ở nhiệt độ phòng, và dùng trong vòng 24 giờ\r\nkể từ khi gạn. Nếu dịch chiết đã để quá 24 giờ, độ tin cậy của dịch chiết ở\r\nđiều kiện bảo quản nên được kiểm tra.
\r\n\r\nB.4.5 Có thể dùng một qui trình chiết để thay\r\nthế, sử dụng dung môi bay hơi, sau đó bốc hơi dung môi và bôi cắn lên súc vật.
\r\n\r\n
\r\n(Qui\r\nđịnh)
\r\n
\r\nsố 3113/ 1999/ QĐ-BYT ngày 11 tháng 10 năm 1999 của Bộ trưởng Bộ Y tế)
Tiêu chuẩn giới hạn vi khuẩn , nấm mốc trong\r\nmỹ phẩm là văn bản qui định về số lượng tối đa vi khuẩn, nấm mốc không được\r\nvượt quá trong mỹ phẩm và phương pháp thử để xác định vi khuẩn, nấm mốc trong\r\nmỹ phẩm.
\r\n\r\nC.1 Giới hạn vi khuẩn và nấm mốc:
\r\n\r\nC.1.1 Trong mỹ phẩm, không được có các vi\r\nkhuẩn sau:
\r\n\r\n- Staphylococcus aureus
\r\n\r\n- Candida albicans
\r\n\r\n- Pseudomonas aeruginosa
\r\n\r\nC.1.2 Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được\r\nkhông được lớn hơn 1000/1 g hoặc 1 ml sản phẩm
\r\n\r\nC.1.3 Tổng số nấm mốc sống lại được không\r\nđược lớn hơn 100/ 1 g hoặc 1 ml sản phẩm
\r\n\r\nC.1.4 Số lượng Enterobacteria và các vi khuẩn\r\nGram âm khác không được lớn hơn 10/ 1 g hoặc 1 ml sản phẩm
\r\n\r\nC.2 Phương pháp thử
\r\n\r\nC.2.1 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử nghiệm
\r\n\r\nC.2.1.1 Lấy mẫu
\r\n\r\nTheo tiêu chuẩn lấy mẫu kiểm nghiệm, một mẫu\r\nđem thử phảI làm ít nhất trên 03 đơn vị đóng gói nhỏ nhất.
\r\n\r\nC.2.1.2 Pha chế mẫu thử nghiệm.
\r\n\r\nTuỳ theo từng sản phẩm, lấy một lượng sản\r\nphẩm đại diện từ các đơn vị đóng gói (khoảng từ 10-50 g hoặc 10-50 ml sản phẩm)\r\nvào bình nón, thêm dung môi pha loãng thích hợp để pha loãng sản phẩm thành các\r\nnồng độ đem thử nghiệm thích hợp như: 10-1, 10-2, 10-3 hoặc 1/2; 1/5 ; 1/20 ;\r\n1/40 v. v. . . sao cho khi đếm khuẩn lạc trên đĩa Petri có đường kính 90-100\r\nmm, số lượng khuẩn lạc không vượt quá 300 trong một đĩa.
\r\n\r\nC.2.2 Dụng cụ và phương tiện thử nghiệm
\r\n\r\nThử nghiệm được tiến hành trong các đIều kiện\r\nvô trùng, đảm bảo không có sự lây nhiễm các vi khuẩn từ ngoàI vào mẫu thử. Các\r\nphương tiện và dụng cụ cần dùng gồm:
\r\n\r\n- Hộp Petri thuỷ tinh có đường kính 90-100 mm
\r\n\r\n- Pipet chia vạch có thể tích 1; 5 và 10 ml.
\r\n\r\n- Bình nón dung tích 100; 250 và 500 ml
\r\n\r\n- Ống nghiệm các loại 16-160 mm; 18-200 mm
\r\n\r\n- Nồi cách thuỷ ổn định được nhiệt độ trong\r\nkhoảng 35-45 0 C
\r\n\r\n- Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 32 0 C 1 0 C
\r\n\r\n- Tủ sấy
\r\n\r\n- Nồi hấp tiệt trùng
\r\n\r\n- Máy đo pH
\r\n\r\nC.2.3 Hoá chất
\r\n\r\n- Thạch dùng cho vi sinh vật
\r\n\r\n- Pepton dùng cho vi sinh vật
\r\n\r\n- Natri clorid tinh khiết (Na Cl)
\r\n\r\n- Glucose tinh khiết
\r\n\r\n- Dinatri hydrophotsphat tinh khiết
\r\n\r\n- Natri dihydrophotsphat
\r\n\r\n- Kali Dihydrophotsphat tinh khiết
\r\n\r\n- Dikali hydrophotsphat tinh khiết
\r\n\r\n- Acid lactic: dung dịch 20 % hoặc 30 %
\r\n\r\n- Acid citric : dung dịch 20 %
\r\n\r\n- Natri hydroxit tinh khiết (NaOH)
\r\n\r\n- Dung dịch natri hydroxit 0,1 N
\r\n\r\n- N-dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid
\r\n\r\n- Magnesi clorid
\r\n\r\n- Cetrimid (Cetyl trimethyl amoni bromid)
\r\n\r\n- Magnesi sulfat ngậm nước
\r\n\r\n- Glycerin
\r\n\r\n- Tween 80
\r\n\r\n- Đỏ trung tính
\r\n\r\n- Tím tinh thể
\r\n\r\n- Xanh Brilliant
\r\n\r\nC.2.4 Môi trường
\r\n\r\nC.2.4.1 Các môi trường dùng để pha loãng, đếm\r\ncác vi khuẩn, nấm mốc
\r\n\r\nC.2.4.1.1 Nước Pepton
\r\n\r\nPepton 1 g
\r\n\r\nNatri clorid 8,5 g
\r\n\r\nNước cất 1000 ml
\r\n\r\nC.2.4.1.2 Nước muối sinh lý
\r\n\r\nNatri clorid 8, 5 g
\r\n\r\nNước cất 1000 ml
\r\n\r\nC.2.4.1.3 Môi trường thạch Saboruaud
\r\n\r\nPepton 10 g
\r\n\r\nGlucose 40 g
\r\n\r\nThạch 15-20 g
\r\n\r\nNước cất 1000 ml
\r\n\r\npH sau khi tiệt trùng: 5,6 6 0,2
\r\n\r\nCách pha: Hoà tan các chất trong nước, đun\r\nnhỏ lửa, khuấy đều cho tan hoàn toàn. Đóng vào các bình dung tích 250 ml, mỗi\r\nbình 150 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp 1100 C trong thời gian 15-20 phút.\r\nMôi trường có thể bảo quản ở 40 C và sử dụng trong vòng 30 ngày.
\r\n\r\nC.2.4.1.4 Môi trường thạch thường
\r\n\r\nPepton 10 g
\r\n\r\nNatri clorid 5 g
\r\n\r\nThạch 15-20 g
\r\n\r\nNước cất 1000 ml
\r\n\r\npH sau khi hấp tiệt trùng 7,4 -7,6
\r\n\r\nC.2.4.2. Các môi trường dùng để phân lập vi\r\nkhuẩn, nấm mốc.
\r\n\r\nC.2.4.2.1 . Môi trường thạch Cetrimid
\r\n\r\nGelatin pancreatic 20,0 g
\r\n\r\nMagnegi clorid 1,4 g
\r\n\r\nGlycerin 10,0 ml
\r\n\r\nCetrimid 0,3 g
\r\n\r\nThạch 13,6 g
\r\n\r\nNước cất 1000 ml
\r\n\r\nCách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong\r\nnước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều; đun sôI 1 phút cho tan hoàn toàn. pH\r\nsau khi tiệt trùng 7,2 0,2.
\r\n\r\nC.2.4.2.2 Môi trường thạch để phát hiện\r\nFluorescin của Pseudomonas
\r\n\r\nCasein pancreatic 10,0 g
\r\n\r\nPepton 10,0 g
\r\n\r\nDikali hydrophotsphat khan 1,5 g
\r\n\r\nMagnesi sulfat ngậm nước 1,5 g
\r\n\r\nThạch 15,0 g
\r\n\r\nGlycerin 10,0 g
\r\n\r\nNước cất 1000 ml.
\r\n\r\nCách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong\r\nnước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều; đun sôI 1 phút cho tan hoàn toàn. pH\r\nsau khi tiệt trùng 7,2 0,2.
\r\n\r\nC.2.4.2.3. Môi trường thạch để phát hiện\r\nPyocyanin của Pseudomonas
\r\n\r\nGelatin pancreatic 20,0 g
\r\n\r\nMagnesi clorid khan 1,4 g
\r\n\r\nKali sunfat khan 10,0 g
\r\n\r\nThạch 15,0 g
\r\n\r\nGlycerin 10,0 ml
\r\n\r\nNước cất 1000 ml.
\r\n\r\nCách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong\r\nnước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôI 1 phút cho tan hoàn toàn. pH\r\nsau khi tiệt trùng là 7,2 0,2.
\r\n\r\nC.2.4.2.4 Môi trường RAT.
\r\n\r\nBột gạo 15,0 g
\r\n\r\nTween 80 10 ml
\r\n\r\nThạch 13,5 g
\r\n\r\nNước cất 1000 ml
\r\n\r\npH sau khi tiệt trùng 4,5 -5,5
\r\n\r\nC.2.4.2.5 MôI trường thạch muối mật có\r\nlactose và glucose, chỉ thị tím tinh thể, đỏ trung tính.
\r\n\r\nCao men bia 3,9 g
\r\n\r\nGelatin pancreatic 7,0 g
\r\n\r\nMuối mật 1,5 g
\r\n\r\nLactose 10,0 g
\r\n\r\nNatri clorid 5,0 g
\r\n\r\nD-glucose monohydrat 10,0 g
\r\n\r\nThạch 15,0 g
\r\n\r\nĐỏ trung tính 30 mg
\r\n\r\nTím tinh thể 2 mg
\r\n\r\nNước cất 1000 ml
\r\n\r\nĐiều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,4 \r\n0,2. Đun tới sôi nhưng không đun trong nồi hấp.
\r\n\r\nC.2.4.2.6 Canh thang làm giầu\r\nEnterobacteriacease - Mossel
\r\n\r\nGelatin pancreatic: 10g
\r\n\r\nD-glucose monohydrat 5,0g
\r\n\r\nMật bò khô: 20,0g
\r\n\r\nKali dihydrophosphat: 2,0g
\r\n\r\nDi natri hydrophosphat: 8,0g
\r\n\r\nXanh Briliant: 15,0mg
\r\n\r\nNước cất: 1000ml
\r\n\r\nĐiều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,2 \r\n0,2. Đun ở 1000 C trong 30 phút và làm lạnh ngay.
\r\n\r\nC.2.4.2.7 Môi trường thạch Manitol-muối.
\r\n\r\nCasein pancreatic 5,0 g
\r\n\r\nPepton 5,0 g
\r\n\r\nCao thịt 1,0 g
\r\n\r\nNatri clorid 75,0 g
\r\n\r\nD-manitol 10,0 g
\r\n\r\nĐỏ phenol 25 mg
\r\n\r\nThạch 15,0 g
\r\n\r\nCách pha: Trộn, đun nóng, khuấy đều, sau đó\r\nđun sôi 1 phút để hoà tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt trùng: 7,4 0,2
\r\n\r\nC.2.4.2.7 Môi trường lỏng Casein đậu tương
\r\n\r\nCasein pancreatic: 0,5 g
\r\n\r\nBột đậu tương ( thuỷ phân bởi papain): 3,0 g
\r\n\r\nNatri clorua: 5,0 g
\r\n\r\nDikali hydrophosphat 2,5 g
\r\n\r\nGlucosa: 2,5 g
\r\n\r\nNước cất: 1000 ml
\r\n\r\nCách pha: Hoà tan các chất rắn vào nước, đun\r\nnóng nhẹ cho tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch ở nhiệt độ phòng, phân chia vào\r\ncác bình thích hợp, đem tiệt trùng, pH sau khi tiệt trùng 7,3 0,2 .
\r\n\r\nC.2.5 Tiến hành nuôI cấy, xác định và phân\r\nlập
\r\n\r\n2.5.1 Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc\r\nsống lại được
\r\n\r\n2.5.1.1 Pha loãng sản phẩm: tiến hành theo\r\nđiều 2.1.2
\r\n\r\n2.5.1.2 Cấy truyền:
\r\n\r\nTrước tiên cấy kiểm tra pipet trên một đĩa\r\nmôi trường phát hiện vi khuẩn và một đĩa môi trường nấm mốc.
\r\n\r\nDùng pipet vô trùng cấy vào mỗi hộp Petri 1\r\nml sản phẩm đã pha loãng, mỗi độ pha loãng cấy vào 2 hộp để xác định số lượng\r\nvi khuẩn hiếu khí sống lại được và 2 hộp để xác định số lượng nấm mốc sống lại\r\nđược.
\r\n\r\nC.2.5.1.3 Đổ đĩa
\r\n\r\nĐun nóng chảy hoàn toàn các loại môi trường\r\ndùng để đếm vi khuẩn, nấm mốc, để nguội đến 450C, rót vào các hộp Petri (đã cấy\r\nsẵn trong mỗi hộp 1 ml của một độ pha loãng của sản phẩm) mỗi hộp 15 - 20 ml\r\nmôi trường; trộn đều sản phẩm đã pha loãng với môi trường bằng cách xoay hộp\r\nPetri qua phải và qua trái mỗi chiều 2-3 lần. Để đĩa thạch đông tự nhiên trên\r\nmặt phẳng ngang.
\r\n\r\nThường dùng môi trường thạch thường để đếm\r\nvi khuẩn hiếu khí
\r\n\r\nThường dùng môi trường Sabouraud để đếm nấm\r\nmốc
\r\n\r\nC.2.5.1.4 Ủ ấm
\r\n\r\nSau khi các đĩa thạch đã đông tự nhiên ở\r\nnhiệt độ phòng, lật ngược đĩa thạch và đem ủ.
\r\n\r\nNhững đĩa thạch dùng để đếm vi khuẩn được ủ ở\r\n32-350C, đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa sau khi ủ 48-72 giờ.
\r\n\r\nNhững đĩa thạch dùng để đếm nấm mốc ở 256\r\n20C, đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa sau khi ủ từ 3-5 ngày.
\r\n\r\nC.2.5.1.5 Tính kết quả
\r\n\r\nSố lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc sống lại\r\nđược có trong 1 g hoặc 1 ml sản phẩm được tính theo công thức sau:
\r\n\r\n\r\n\r\n
trong đó:
\r\n\r\nM = Số lượng vi khuẩn, nấm mốc sống lại được\r\ncó trong 1 g hoặc 1 ml sản phẩm.
\r\n\r\nC = Tổng số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa\r\nPetri cùng một độ pha loãng.
\r\n\r\nn = Số đĩa trong một độ pha loãng
\r\n\r\nd = độ pha loãng
\r\n\r\nN= Số độ pha loãng (thí dụ đếm hai độ pha\r\nloãng 101 và 102 : N =2; đếm ở những độ pha loãng 2,5 và 10 thì N = 3 v.v...)
\r\n\r\n2.5.2 Phân lập vi khuẩn
\r\n\r\n2.5.2.1 Tìm Staphylococcus aureus
\r\n\r\nCho chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng\r\ncasein đậu tương, ủ ấm 350C trong khoảng 24-48 giờ. Quan sát môI trường, nếu\r\nthấy vi khuẩn mọc, dùng que cấy lấy một quai cấy, cấy lên một đĩa thạch Mannitol-\r\nmuối. Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri, đem ủ ấm ở 350C trong 24 giờ. Sau khi ủ ấm,\r\nkiểm tra nếu thấy:
\r\n\r\nTrên đĩa thạch Mannitol- muối có thấy những\r\nkhuẩn lạc màu vàng cùng với một vùng mầu vàng xung quanh, dùng que cấy lấy\r\nkhuẩn lạc đIển hình, đem nhuộm Gram, soi kính thấy tụ cầu khuẩn hình chùm nho,\r\nbắt mầu gram dương, đường kính khoảng 0,8 - 1mm; tiếp tục làm các phản ứng sinh\r\nvật hoá học của Staphylococcus aureus. Chuyển một lạc khuẩn nghi ngờ đặc trưng\r\nvào ống nghiệm nhỏ, sạch vô trùng, thêm vào ống 0,5 ml huyết tương thỏ. Đem ủ\r\nấm cách thuỷ 370C; sau 3 giờ ủ ấm, kiểm tra các ống thử, tiếp tục ủ ấm thêm 24\r\ngiờ. Nếu thấy có hiện tượng đông huyết tương ở bất kỳ mức độ nào- sản phẩm có Staphylococcus\r\naureus.
\r\n\r\n2.5.2.2 Tìm Pseudomonas aeruginosa
\r\n\r\nCho chế phẩm vào 100 ml môI trường lỏng\r\ncasein đậu tương, ủ ấm ở 350C trong 24-48 giờ. Quan sát môi trường, nếu thấy vi\r\nkhẩn mọc, dùng dùng que cấy lấy một quai cấy, cấy lên một đĩa thạch Cetrimid.\r\nđậy đĩa, lật ngược hộp Petri và đem ủ ấm ở 350C trong 24 giờ. sau khi ủ ấm,\r\nkiểm tra nếu thấy:
\r\n\r\nTrên môi trường thạch Cetrimid có khuẩn lạc\r\nmàu lục nhạt, có ánh huỳnh quang màu lục, thì lấy khuẩn lạc , nhuộm gram và soi\r\nkính. Nếu thấy trực khuẩn Gram âm và phản ứng oxydaza dương tính thì tiếp tục\r\ncấy truyền trên mặt môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện fluorescin và môI\r\ntrường thạch Pseudomonas để phát hiện pyocyamin trong hộp Petri. Đậy và lật\r\nngược hộp môi trường đã cấy truyền, đem ủ ấm ở 35 20C trong ít nhất 3 ngày,\r\nđem kiểm tra các đĩa thạch dưới ánh đèn tử ngoại, nếy thấy:
\r\n\r\nTrên đĩa thạch Pseudomonas để phát hiện\r\nfluorescin có khuẩn lạc không màu đến màu vàng, có huỳnh quang hơi vàng.
\r\n\r\nTrên đĩa thạch Pseudomonas để phát hiện\r\npyocyamin có khuẩn lạc màu vàng nhạt, có huỳnh quang màu xanh nước biển.
\r\n\r\nTiếp tục nhuộm gram, soi kính và làm phản\r\nứng oxydaza thấy trực khuẩn gram âm, phản ứng oxydaza dương tính, có thể kết\r\nluận có Pseudomonas aeruginosa.Nếu chưa chắc chắn có thể tiếp tục kiểm tra bằng\r\ncác phép thử sinh hoá khác.
\r\n\r\nThử phản ứng oxydaza: Chuyển khuẩn lạc vào\r\nmẩu giấy đã tẩm trước N-dimethyl phenylen diamin dihydroclorid, nếu thấy hiện\r\nmầu đỏ hồng, chuyển sang màu tím: phản ứng oxydaza dương tính.
\r\n\r\n2.5.2.3 Enterobacteriaceae và các vi khuẩn\r\ngam âm khác.
\r\n\r\nLàm đồng nhất chế phẩm đem kiểm tra bằng cách\r\nxử lý một lượng thích hợp như đã mô tả ở trên và ủ ấm ở 35-37 0 C trong một\r\nthời gian thích hợp để phục hồi lại vi khuẩn, nhưng không phảI làm tăng vi\r\nkhuẩn (thường từ 2-5 h). Lắc bình chứa và chuyển một lượng chế phẩm đã đồng\r\nnhất tương đương với khoảng 1 g hoặc 1 ml chế phẩm vào 100 ml môi trường canh\r\nthang làm giầu Enterobacteriaceae - Mosel và ủ ấm ở 35-37 0C trong 18-24 h.Cấy\r\nlên đĩa thạch muối mật có lactose, glucose, chỉ thị tím tinh thể và đỏ trung\r\ntính, ủ ấm ở 35- 370C trong 18- 48 h. Chế phẩm không có Enterobacteriaceae nếu\r\nkhông thấy mọc những khuẩn lac vi khuẩn gram âm trên thạch đĩa.
\r\n\r\nĐánh giá số lượng: Ủ ấm một lượng thích hợp\r\nmôi trường canh thang làm giầu Enterobacteriaceae - Mosel với nhữnglượng chế\r\nphẩm đem kiểm tra đã được làm giầu đồng nhất chứa 1,0 g; 0,1 g; và 0,01 g hoặc\r\n1,0 ml; 0,1 ml và 0,01 m. Chế phẩm có thể được pha loãng khi cần. ủ ấn ở\r\n350-370 C trong 24 đến 48 giờ. Sự mọc của các khuẩn lạc đã phát triển tốt\r\nthường đỏ hoặc đĩa đỏ, vi khuẩn gram âm chứng tỏ kết quả dương tính. Ghi lượng\r\nnhỏ nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả dương tính và lượng lớn nhất của chế\r\nphẩm mà ở đó cho kết quả âm tính. Xác định theo bảng sau số lượng Bacteria
\r\n\r\nBảng B1- Tính lượng Bacteria trong chế phẩm
\r\n\r\n| \r\n \r\n Kết quả đối với mỗi lượng sản phẩm \r\n | \r\n \r\n \r\n Số bacteria có trong 1 g sản phẩm \r\n | \r\n ||
| \r\n 1,0 g hoặc 1,0 ml \r\n | \r\n \r\n 0,1 g hoặc 0,1 ml \r\n | \r\n \r\n 0,01 g hoặc 0,01 ml \r\n | \r\n |
| \r\n + \r\n | \r\n \r\n + \r\n | \r\n \r\n + \r\n | \r\n \r\n Lớn hơn 102 \r\n | \r\n
| \r\n + \r\n | \r\n \r\n + \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n Ít hơn 10 2 nhưng lớn hơn 10 \r\n | \r\n
| \r\n + \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n Ít hơn 10 nhưng lớn hơn 1 \r\n | \r\n
| \r\n - \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n Ít hơn 1 \r\n | \r\n
\r\n\r\n
2.5.2.4 Tìm Candida albicans
\r\n\r\nTiến hành trên môI trường thạch Sabouraud
\r\n\r\nVào cuối giai đoạn ủ ấm, kiểm tra bằng kính\r\nhiển vi xem có nấm mọc hay không. Kiểm tra sự có khuẩn lạc nghi ngờ Candida\r\nalbicans. Lấy khuẩn lạc đIển hình đem nhuộm gram, soi kính: Candida albicans có\r\nhình tròn, bầu dục đường kính 6-9 mm, bắt màu gram dương.
\r\n\r\nThử nghiệm mầm giá đậu:
\r\n\r\nLấy một giọt huyền dịch nấm đã nuôI cấy sau\r\n24 h vào ống nghiệm nhỏ có chứa 1 ml huyết thanh thỏ, ủ ấm ở 370 C trong 3 h,\r\nsau đó lấy ra soi giữa bản và lá kính. Nếu là nấm Candida albicans thì gần như\r\ntoàn bộ số tế bào sẽ nẩy mầm giống như hình - giá đậu .
\r\n\r\nTìm tế bào vách dày: Cho môI trường RAT lên\r\nbản kính vô khuẩn, nhỏ vào một giọt huyền dịch nấm , đậy lá kính, đọc kết qảu\r\nsau 24 - 48 giờ ủ ấm ở 30 0C
\r\n\r\nTừ khóa: Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN6972:2001, Tiêu chuẩn Việt Nam số TCVN6972:2001, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN6972:2001 của Bộ Khoa học Công nghệ và Mội trường, Tiêu chuẩn Việt Nam số TCVN6972:2001 của Bộ Khoa học Công nghệ và Mội trường, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN6972:2001 của Bộ Khoa học Công nghệ và Mội trường, TCVN6972:2001
File gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6972:2001 về nước gội đầu do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6972:2001 về nước gội đầu do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Bộ Khoa học Công nghệ và Mội trường |
| Số hiệu | TCVN6972:2001 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2001-12-28 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Hóa chất |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |