\r\n\r\n

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

\r\n\r\n

TCVN 8379:2010

\r\n\r\n

TÔM VÀ\r\nSẢN PHẨM TÔM –

\r\n\r\n

PHÁT\r\nHIỆN VIRUT GÂY BỆNH HOẠI TỬ DƯỚI VỎ VÀ CƠ QUAN TẠO MÁU (IHHNV) BẰNG KỸ\r\nTHUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP (PCR)

\r\n\r\n

Shrimp and shrimp products –

\r\n\r\n

 Detection of infectious hypodermal\r\nand haematopoietic necrosis virus (IHHNV) by polymerase chain reaction (PCR)

\r\n\r\n

Lời nói đầu

\r\n\r\n

TCVN 8379 : 2010 do Cục Quản lý Chất\r\nlượng Nông Lâm sản và Thuỷ sản biên soạn, Bộ\r\nNông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo\r\nlường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

CẢNH BÁO – Để đảm bảo an toàn cho nhân viên,\r\ncác thao tác phân tích chỉ được thực hiện trong các phòng thử nghiệm được trang\r\nbị thích hợp, dưới sự kiểm soát của cán bộ thử nghiệm có kinh nghiệm. Etidi\r\nbromua (EB) là chất có khả năng gây ung thư. Vì vậy phải mang găng tay, đeo\r\nkính và mặc quần áo bảo hộ để tránh tiếp xúc. Nên đánh dấu rõ ràng thiết bị và\r\ndụng cụ tiếp xúc với EB và không di chuyển chúng ra khỏi khu vực quy định. Để\r\nchất thải có chứa EB trong vật chứa và có phương pháp loại bỏ thích hợp.

\r\n\r\n

1. Phạm vi áp dụng

\r\n\r\n

Tiêu chuẩn\r\nnày quy định phương pháp phát hiện virut gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan\r\ntạo máu (IHHNV) trên tôm và sản phẩm của tôm thuộc chi Tôm he (Penaeus)\r\nbằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).

\r\n\r\n

2. Tài liệu viện dẫn

\r\n\r\n

Các\r\ntài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với\r\ncác tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với\r\ncác tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao\r\ngồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

\r\n\r\n

ISO\r\n22174 : 2005, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase\r\nchain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General\r\nrequirements and definitions (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn\r\nchăn nuôi – Phản ứng chuỗi trùng hợp để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực\r\nphẩm – Yêu cầu chung và định nghĩa).

\r\n\r\n

3. Thuật ngữ và định\r\nnghĩa

\r\n\r\n

Trong tiêu\r\nchuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

\r\n\r\n

3.1 Virut gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) [(Infectious hypodermal\r\nand haematopoietic necrosis virus (IHHNV)]

\r\n\r\n

Virut gây\r\nbệnh ở tôm, thuộc chi Brevidensovirus, họ Parvoviridae, có kích\r\nthước từ 20 nm đến 22 nm, không có màng bao icosahedron, mật độ\r\n1,40 g/ml trong CsCl, chứa DNA mạch đơn dạng thẳng có kích thước ước\r\nkhoảng 4,1 kb và có capsid gồm bốn polypeptide với khối lượng phân tử 74,\r\n47, 39 và 37,5 kDa.

\r\n\r\n

3.2 Phát hiện virut gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan\r\ntạo máu (Detection of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis\r\nvirus)

\r\n\r\n

Việc xác\r\nđịnh sự có hoặc không có virut IHHNV (3.1) trong một khối lượng cụ thể của sản\r\nphẩm khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

\r\n\r\n

4. Nguyên tắc

\r\n\r\n

4.1 Phương pháp phân tích định tính này dựa vào việc xác định đoạn\r\nDNA đích có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng\r\ncách điện di sản phẩm khuếch đại trên bảng thạch, nhuộm màu DNA và quan sát\r\ndưới ánh sáng tử ngoại (UV) có bước sóng 302 nm.

\r\n\r\n

4.2 Quy trình phát hiện virut IHHNV bằng kỹ thuật PCR cần qua bốn\r\ngiai đoạn kế tiếp nhau: tách chiết DNA; khuếch đại DNA; điện di để phát hiện\r\nDNA và đọc kết quả (xem thêm Phụ lục A).

\r\n\r\n

5. Thuốc thử và vật liệu\r\nthử

\r\n\r\n

Trong mọi trường hợp, chỉ sử\r\ndụng các thuốc thử tinh khiết phân tích thích hợp cho các ứng dụng sinh học\r\nphân tử. Việc pha chế, bảo quản và sử dụng thuốc thử phải tuân thủ theo hướng\r\ndẫn của nhà sản xuất. Nhìn chung, nên lấy lượng cần thiết vừa đủ các dung dịch\r\nphản ứng cho phép thử PCR và bảo quản chúng trong điều kiện thích hợp.

\r\n\r\n

5.1 Mồi

\r\n\r\n

Mồi đặc\r\nhiệu của virut IHHNV sử dụng trong kỹ thuật PCR gồm hai cặp mồi: cặp mồi\r\n309F/309R khuếch đại đoạn DNA của IHHNV và cặp mồi MG831F/MG831R khuếch đại\r\ntrình tự DNA của tôm tương đồng với DNA của virut IHHNV. Mồi có trình tự cụ thể\r\nnhư sau:

\r\n\r\n\r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n

\r\n Mồi \r\n	\r\n Trình tự \r\n	\r\n Sản phẩm \r\n
\r\n 309F \r\n	\r\n 5’-TCC-AAC-ACT-TAG-TCA-AAA-CCA-A-3’ \r\n	\r\n 309 bp \r\n
\r\n 309R \r\n	\r\n 5’-TGT-CTG-CTA-CGA-TGA-TTA-TCC-A-3’ \r\n
\r\n MG831F \r\n	\r\n 5’-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3’ \r\n	\r\n 831 bp \r\n
\r\n MG831R \r\n	\r\n 5’-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3’ \r\n

\r\n\r\n

Nồng độ\r\ncủa mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 25 mM trong dung dịch đệm\r\nTE. Dung dịch đệm TE chứa Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) và EDTA 1 mM.

\r\n\r\n

5.2 Các thuốc thử tách chiết DNA

\r\n\r\n

5.2.1 Dung dịch đệm ly trích

\r\n\r\n

5.2.1.1 Thành phần

\r\n\r\n\r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n

\r\n Thuốc thử \r\n	\r\n Khối lượng \r\n	\r\n Nồng độ cuối \r\n
\r\n Tris (hydroxymetyl)-aminometan \r\n	\r\n 6,06 g \r\n	\r\n 50 mM \r\n
\r\n Etylendiaminetetra axetic axit\r\n (EDTA) \r\n	\r\n 0,37 g \r\n	\r\n 1 mM \r\n
\r\n Natri clorua (NaCl) \r\n	\r\n 29,22 g \r\n	\r\n 500 mM \r\n
\r\n Natri dodexyl sulfat (SDS) \r\n	\r\n 10,0 g \r\n	\r\n 1 % \r\n
\r\n Proteinaza K (chỉ thêm vào trước\r\n khi tách chiết) \r\n	\r\n   \r\n	\r\n 10 µg/ml \r\n
\r\n Nước vừa đủ \r\n	\r\n 1000 ml \r\n	\r\n   \r\n
\r\n pH 8,0 \r\n

\r\n\r\n

5.2.1.2 Chuẩn bị

\r\n\r\n

Sử dụng\r\nnước cất hai lần vô trùng ít hơn thể tích cuối cùng để hòa tan Tris, EDTA và\r\nNaCl, khuấy và đảo đều dung dịch. Ở pH thấp, EDTA sẽ tan dễ dàng. Sử dụng HCl\r\nđể chỉnh pH dung dịch về giá trị 8,0. Cuối cùng thêm lượng SDS cần thiết vào\r\ndung dịch và thêm nước cho đủ thể tích cuối. Nên hấp khử trùng dung dịch này để\r\nbất hoạt DNA nhiễm vào và giữ được dung dịch đệm lâu hơn.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH\r\n1 Trước khi sử dụng dung dịch đệm ly trích nên bổ sung thêm proteinaza K với\r\nnồng độ như trên. Ví dụ: thêm 50 ml\r\ndung dịch Proteinaza K nồng độ gốc 20mg/ml vào mỗi 10ml dung dịch đệm ly trích.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH\r\n2 Nên sử dụng thuốc thử và các sản phẩm dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được\r\ntổng hợp thành bộ chế phẩm dạng thương mại lưu hành trên thị trường có thành\r\nphần phù hợp như dưới đây.

\r\n\r\n

Quá trình\r\npha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong\r\ntrường hợp sử dụng thuốc thử và vật liệu riêng lẻ, độ tinh khiết của các thành\r\nphần và nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho sinh học phân tử.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH\r\n3 Có nhiều quy trình dùng để tách chiết axit nucleic (DNA) từ mô động vật. Đối\r\nvới mô tôm, việc tách chiết DNA là không quá khó, vì vậy trong quy trình trên\r\nđề cập đến phương pháp tách chiết bằng dung dịch đệm ly trích là phương pháp\r\nđơn giản, dễ thực hiên. Tuy nhiên, tuỳ thuộc vào việc sử dụng sản phẩm PCR vào\r\nmục đích tạo dòng, lai… nên chọn các phương pháp thích hợp và tối ưu hơn, ví dụ\r\nnhư phương pháp dùng hệ thống cột ly tâm để tách chiết DNA hoặc sử dụng các bộ\r\nchế phẩm tách chiết thương mại có bán sẵn.

\r\n\r\n

5.2.2 Tách chiết DNA dùng hệ thống cột ly tâm

\r\n\r\n

5.2.2.1 Dung dịch đệm ly giải mô

\r\n\r\n

urê\r\n4M, Tris 200 mM, NaCl 20 mM, EDTA 200 mM, có pH 7,4. Bảo quản ở 25 ^oC.

\r\n\r\n

5.2.2.2 Dung dịch đệm liên kết

\r\n\r\n

Guanidin-HCl\r\n6M, urê 10 mM, Tris-HCl 10 mM, Triton X-100 20 % (phần thể tích), có pH 4,4.\r\nBảo quản ở 25 ^oC.

\r\n\r\n

5.2.2.3 Proteinaza K.

\r\n\r\n

5.2.2.4 Dung dịch đệm loại bỏ chất\r\nức chế

\r\n\r\n

Thêm vào\r\n20 ml etanol tinh khiết guanidin-HCl 5 M và Tris-HCl 20 mM, có pH 6,6. Bảo quản\r\nở 25 ^oC.

\r\n\r\n

5.2.2.5 Dung dịch đệm rửa

\r\n\r\n

Thêm vào\r\n80 ml etanol tinh khiết NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, có pH 7,5.

\r\n\r\n

5.2.2.6 Dung dịch đệm rửa giải

\r\n\r\n

Tris-HCl\r\n10 mM, có pH 8,5. Bảo quản ở 25 ^oC.

\r\n\r\n

5.3 Pha chế dung dịch đệm TE\r\n(dùng để\r\npha loãng cặn DNA)

\r\n\r\n

Hòa tan\r\nTris 10 mM với EDTA 1 mM, chỉnh pH về giá trị 7,6 bằng dung dịch HCl.

\r\n\r\n

5.4 Hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (Master mix)

\r\n\r\n

5.4.1 Thành\r\nphần

\r\n\r\n\r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n

\r\n Thuốc thử \r\n	\r\n 25 ml hỗn hợp thuốc thử \r\n	\r\n Nồng độ cuối \r\n
\r\n Nước cất hai lần \r\n	\r\n 16,0 ml \r\n	\r\n   \r\n
\r\n Dung dịch đệm đậm đặc 10 lần \r\n	\r\n 2,5 ml \r\n	\r\n Đậm đặc 1 lần \r\n
\r\n dNTP \r\n	\r\n 0,5 ml cho mỗi loại \r\n	\r\n 200 mM cho mỗi loại \r\n
\r\n Hỗn hợp mồi A \r\n	\r\n 0,5 ml \r\n	\r\n 0,31 mM \r\n
\r\n Hỗn hợp mồi B \r\n	\r\n 0,5 ml \r\n	\r\n 0,31 mM \r\n
\r\n MgCl2 \r\n	\r\n 2,0 ml \r\n	\r\n 2 mM \r\n
\r\n Enzym \r\n	\r\n 0,5 ml \r\n	\r\n 2,5 U \r\n

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH Hỗn hợp mồi A, B\r\ntương ứng với các trình tự 309 F/R, MG831 F/R.

\r\n\r\n

5.4.2 Có thể sử dụng hỗn hợp phản ứng PCR\r\nnhư PCR - hạt, thành phần gồm chất ổn định: BSA, dNTP, khoảng 2,5 đơn vị Taq\r\nDNA polymeraza và dung dịch đệm phản ứng. Trước khi sử dụng hạt, cần hoàn\r\nnguyên đến thể tích cuối 25 µl, nồng độ mỗi dNTP là 200 µM trong Tris-HCl 10\r\nmM, có pH 9,0 ở nhiệt độ phòng, KCl 50 mM và MgCl₂ 1,5 mM. Nên\r\nsử dụng hỗn hợp phản ứng PCR được bán sẵn trên thị trường.

\r\n\r\n

5.5 Thang DNA

\r\n\r\n

Sử dụng\r\nthang đo phù hợp để ước lượng được đoạn khuếch đại 309 bp và 831 bp. Có thể sử\r\ndụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 309 bp và 831 bp đã biết trước.

\r\n\r\n

5.6 Pha chế một số hoá chất điện di

\r\n\r\n

5.6.1 Dung\r\ndịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA đậm đặc 10 lần)

\r\n\r\n

Hòa tan\r\n108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước. Sau đó, thêm 40 ml EDTA 0,5 M\r\nvà thêm nước cho đủ 1 l. Hấp vô trùng ở 121 ^oC trong 15 min. Bảo\r\nquản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng mới pha loãng với nước cất vô trùng thành\r\ndung dịch đậm đặc 0,5 lần.

\r\n\r\n

5.6.2 EDTA\r\n(etylen diamin\r\ntetra axetic) 0,5 M

\r\n\r\n

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước rồi chỉnh cho dung dịch có pH 8,0\r\nbằng dung dịch NaOH 4\r\nN. Sau đó, thêm nước cất cho đủ 500 ml. Tiến hành hấp vô trùng và bảo quản ở\r\nnhiệt độ phòng.

\r\n\r\n

5.6.3 Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm\r\nđặc 6 lần

\r\n\r\n

Hoà\r\ntan các thành phần: Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen\r\nxyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM.

\r\n\r\n

5.6.4 Dung dịch\r\ndietypyrocarbonat (DEPC)

\r\n\r\n

Trộn 0,1 % (phần thể tích)\r\ndietypyrocarbonat vào nước cất, lắc khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín,\r\nnới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 ^oC trong 15 min.

\r\n\r\n

5.6.5 Tạo bảng thạch 1,5 % (Gel agaroza 1,5 %)

\r\n\r\n

5.6.5.1 Tạo bảng thạch 1,5 %

\r\n\r\n

Đun tan hoàn toàn 1,5 g agaroza\r\ntrong 100 ml dung dịch đệm TBE đậm đặc 0,5 lần. Để nguội ở nhiệt độ phòng\r\nkhoảng 10 min (đạt 55 °C đến 60 °C).

\r\n\r\n

5.6.5.2 Dung\r\ndịch etidi bromua, nồng độ 10 mg/ml

\r\n\r\n

5.6.5.3 Nhuộm trong

\r\n\r\n

Chuyển agaroza vừa đun vào một chai chuyên dùng để pha etidi bromua, sau\r\nđó cho vào 4ml etidi bromua 10 mg/ml (cho 4 ml etidi bromua 10 mg/ml vào 100 ml dung dịch\r\nagaroza), trộn đều (tránh tạo bọt khí). Chuẩn\r\nbị khuôn, cân bằng mặt khuôn bằng giọt nước, gắn lược vào khuôn, sau đó đổ agaroza vào khuôn đạt độ dày khoảng 3 mm đến 5 mm. Để\r\nđông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Gỡ lược, đặt bảng thạch vào trong máng điện di, các giếng của bảng thạch\r\nphải ở phía gần điện cực âm. Đổ dung dịch TBE đậm đặc 0,5 lần cho đến khi ngập\r\nbảng thạch trước khi cho mẫu vào để điện di.

\r\n\r\n

5.6.5.4 Nhuộm ngoài

\r\n\r\n

Sau khi điện di, ngâm bảng thạch vào\r\ndung dịch etidi bromua 10 mg/ml (5 µl hoà tan trong 100 ml nước cất). Dung dịch này phải bao phủ toàn bộ bảng\r\nthạch. Lắc nhẹ trong khoảng 20 min. Sau đó, vớt bảng thạch ra khỏi dung dịch\r\nnhuộm, rửa với nước cất trong 10 min để loại bỏ dung dịch nhuộm còn dư trên bề\r\nmặt bảng thạch.

\r\n\r\n

6 Thiết bị và dụng cụ

\r\n\r\n

Sử dụng các thiết bị, dụng\r\ncụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:

\r\n\r\n

6.1\r\nBộ nghiền mẫu vô trùng.

\r\n\r\n

6.2 Máy ly tâm, có thể hoạt động với tốc độ\r\ntối đa trên 12 000 r/min.

\r\n\r\n

6.3 Máy luân nhiệt.

\r\n\r\n

6.4 Bộ điện di, gồm nguồn và buồng điện di.

\r\n\r\n

6.5 Bàn đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm hoặc\r\nthiết bị chụp ảnh để lưu kết quả.

\r\n\r\n

6.6 Micropipet, dung tích 10 µl; 20 µl; 100\r\nµl; 1000 µl.

\r\n\r\n

6.7 Ống nghiệm đáy côn (ống Eppendorf), dung tích 1,5 ml và 0,2 ml.

\r\n\r\n

6.8 Ðầu típ các loại, có đầu lọc với thể tích\r\nkhông lớn hơn 10 µl.

\r\n\r\n

6.9 Khuôn, khay, lược dùng để tạo bảng thạch.

\r\n\r\n

6.10 Ống lọc tinh, có 2 lớp màng lọc, có thể chứa 700\r\nµl dịch mẫu.

\r\n\r\n

6.11 Ống góp, dùng bọc ngoài ống lọc tinh.

\r\n\r\n

7. Cách tiến hành

\r\n\r\n

7.1 Chuẩn bị mẫu

\r\n\r\n

7.1.1 Đối với mẫu tôm hậu ấu trùng: lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ\r\n10 đến 30 nguyên con. Đối với tôm hậu ấu trùng 11 ngày tuổi trở lên loại bỏ\r\nđầu.

\r\n\r\n

7.1.2 Đối với mẫu tôm bố mẹ: lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ\r\n100 mg đến 200 mg cuống mắt hoặc một phần chân bơi.

\r\n\r\n

7.1.3 Đối với mẫu tôm thương phẩm: lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ\r\n100 mg đến 200 mg phiến mang tôm, chân bơi, chân bò, cơ hoặc khoảng 100 µl dịch\r\nbạch huyết của tôm.

\r\n\r\n

7.1.4 Yêu cầu đối với mẫu để phân\r\ntích: mẫu tôm còn\r\nsống và bảo quản trong cồn 95 % ngay sau khi lấy. Thể tích cồn sử dụng để bảo\r\nquản không nên nhỏ hơn 3 lần thể tích mẫu cần phân tích. Sau khi cố định, mẫu\r\nđược lưu giữ ở nhiệt độ khoảng từ 25 ^oC đến 30 ^oC trong 1\r\ntuần lễ. Khi cần bảo quản mẫu lâu hơn nữa phải thay cồn mới.

\r\n\r\n

7.2 Tách chiết DNA

\r\n\r\n

Có thể sử dụng một trong hai phương\r\npháp tách chiết DNA sau:

\r\n\r\n

7.2.1 Sử dụng dung dịch đệm ly trích\r\n(5.2.1)

\r\n\r\n

7.2.1.1 Cho khoảng 100 mg đến 200 mg mẫu tôm\r\n(7.1) cho vào ống nghiệm đáy côn có thể tích 1,5 ml, bổ sung 500 µl dung dịch đệm ly trích (5.2.1),\r\nnghiền nhuyễn mẫu.

\r\n\r\n

7.2.1.2 Ủ mẫu ở 95 ^oC trong 10\r\nmin.

\r\n\r\n

7.2.1.3 Ly tâm với tốc độ 12 000 r/min\r\ntrong 10 min.

\r\n\r\n

7.2.1.4 Chuyển 200 µl dịch nổi phía trên\r\nvào ống ống nghiệm đáy\r\ncôn 1,5 ml sạch.

\r\n\r\n

7.2.1.5 Thêm 400 µl etanol 95 %.

\r\n\r\n

7.2.1.6 Trộn nhanh bằng máy trộn rung\r\n(vortex), ly tâm với tốc độ 12 000 r/min trong 5 min.

\r\n\r\n

7.2.1.7 Gạn bỏ dung dịch etanol, giữ lại\r\ncặn.

\r\n\r\n

7.2.1.8 Làm khô cặn DNA ở nhiệt độ phòng.

\r\n\r\n

7.2.1.9 Hoà tan phần cặn trên với dung dịch\r\nDEPC (5.6.4) hoặc dung\r\ndịch đệm TE (5.3).

\r\n\r\n

7.2.2 Sử dụng hệ thống cột ly tâm (5.2.2)

\r\n\r\n

7.2.2.1 Cho khoảng 100 mg đến 200 mg mẫu\r\ntôm (7.1) vào ống nghiệm đáy côn 1,5 ml, bổ sung 200 µl dung dịch đệm ly giải\r\nmô, nghiền mẫu với chày nghiền vô trùng.

\r\n\r\n

7.2.2.2 Tiếp tục thêm 50 µl enzym\r\nproteinaza K, trộn đều dung dịch, ủ các ống nghiệm đáy côn ở 55 ^oC\r\ntrong 1 h.

\r\n\r\n

7.2.2.3 Thêm 200 µl dung dịch đệm liên kết,\r\ntrộn đều ngay và đem ủ ở 70 ^oC trong 10 min.

\r\n\r\n

7.2.2.4 Làm ấm lọ có dung dịch đệm rửa giải\r\nở 70 ^oC.

\r\n\r\n

7.2.2.5 Ly tâm các ống nghiệm đáy côn 1,5\r\nml ở tốc độ cao nhất có thể trong 30 s nhằm loại bỏ mô chưa thủy phân.

\r\n\r\n

7.2.2.6 Chuyển phần dịch nổi sang các ống\r\nnghiệm đáy côn 1,5 ml mới chứa sẵn 100 µl isopropanol. Trộn đều và chuyển toàn\r\nbộ dung dịch sang các ống lọc tinh có gắn ống góp.

\r\n\r\n

7.2.2.7 Ly tâm các ống với tốc độ 8 000 r/min\r\ntrong 1 min. Bỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp\r\nmới.

\r\n\r\n

7.2.2.8 Thêm 500 µl dung dịch loại bỏ chất\r\nức chế vào các lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Bỏ ống góp\r\nchứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng góp mới.

\r\n\r\n

7.2.2.9 Thêm 500 µl dung dịch đệm rửa vào\r\ncác lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Bỏ ống góp chứa phần\r\ndung dịch thu được và thay thế bằng góp mới.

\r\n\r\n

7.2.2.10 Lặp lại bước 7.2.2.8 và 7.2.2.9.

\r\n\r\n

7.2.2.11 Ly tâm các ống góp chứa ống lọc\r\ntinh trong 20 s ở tốc độ cao nhất có thể để loại bỏ hoàn toàn dung dịch đệm\r\nrửa.

\r\n\r\n

7.2.2.12 Chuyển các ống lọc tinh sang các\r\nống nghiệm đáy côn 1,5 ml. Thêm 100 µl dung dịch đệm rửa giải có nhiệt độ 70 ^oC,\r\nly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Loại bỏ phần ống lọc tinh. Thu được\r\ndung dịch DNA ở các ống nghiệm đáy côn.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH Do nguồn mẫu khác nhau có\r\nhàm lượng DNA không giống nhau, vì vậy cần điều chỉnh nồng độ DNA bằng cách hoà\r\ntan DNA vào các thể tích dung dịch DEPC hoặc dung dịch TE phù hợp theo lượng\r\nDNA thu được. Việc xác định hàm lượng DNA có thể tiến hành bằng cách đo giá trị\r\nmật độ quang (OD) của dịch pha loãng theo tỉ lệ 1:5 (10 µl dịch DNA thu được:\r\n40 µl nước) ở bước sóng 260 nm (OD₂₆₀) hoặc bằng cách điện di 10 µl\r\ndịch DNA thu được ở nồng độ thạch 1,5 %.

\r\n\r\n

Nếu các mẫu phải bảo quản trong thời\r\ngian dài, nên sử dụng dung dịch đệm TE để hoà tan cặn DNA và bảo quản ở –20 ^oC.\r\nSử dụng ngay dịch này cần phải bảo quản ở 2 ^oC đến 8 ^oC.

\r\n\r\n

7.3 Khuếch đại DNA

\r\n\r\n

Để đảm bảo kết quả phân tích có độ\r\ntin cậy cao nên quá trình khuếch đại cần chuẩn bị đầy đủ các yếu tố sau:

\r\n\r\n

a) DNA của mẫu đã biết trước không\r\ncó virut IHHNV;

\r\n\r\n

b) DNA của mẫu đã biết trước dương\r\ntính IHHNV (bao gồm mẫu mô, máu hoặc plasmid); DNA mẫu trắng (nước cất hai\r\nlần).

\r\n\r\n

7.3.1 Mẫu

\r\n\r\n

1 µl dịch chiết DNA cho vào ống chứa\r\nhỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (5.4.1 hoặc 5.4.2).

\r\n\r\n

7.3.2 Mẫu kiểm chứng dương tính

\r\n\r\n

1 µl mẫu kiểm chứng dương tính cho\r\nvào một chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (5.4.1 hoặc 5.4.2).

\r\n\r\n

7.3.3 Mẫu kiểm chứng âm tính

\r\n\r\n

1 µl mẫu kiểm chứng âm tính cho vào\r\nmột ống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (5.4.1 hoặc 5.4.2).

\r\n\r\n

7.3.4 Khuếch đại phản ứng PCR

\r\n\r\n

Sau khi\r\ncho dịch tách chiết mẫu, mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính vào\r\nống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR đã được đánh dấu, đậy nắp ống thật\r\nchặt, ly tâm nhẹ để dung dịch tụ hết xuống đáy ống không còn dính trên thành\r\nống. Đặt các ống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR vào máy luân nhiệt thực\r\nhiện phản ứng theo chương trình sau:

\r\n\r\n\r\n\r\n

Giữ ở 4 ^oC\r\ncho đến khi phân tích.

\r\n\r\n

7.4 Điện di

\r\n\r\n

7.4.1 Cho 5 đến 7 µl dung dịch đệm tải mẫu\r\n(5.6.3) vào các ống sản phẩm khuếch đại (7.3.4) trộn đều.

\r\n\r\n

7.4.2 Hút khoảng 5 ml đến 7 ml\r\ntừ các ống (7.4.1): mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu kiểm chứng dương tính, thang\r\nDNA chuẩn, các mẫu vào mỗi giếng trên bảng thạch. Trình tự hút mẫu cho vào\r\ngiếng: mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu thử, mẫu kiểm chứng dương tính, thang DNA\r\nchuẩn.

\r\n\r\n

7.4.3 Điện di ở hiệu điện thế 100 V đến\r\n120 V. Sau khi nối điện, quan sát bong bóng khí từ hai phía của điện cực.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH Dung dịch đệm tải mẫu gồm\r\nhai thành phần màu: màu xanh đậm là chỉ thị bromphenol blue; màu xanh nhạt là\r\nchỉ thị xylen cyanol. Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng\r\nkhoảng 2/3 chiều dài bảng gel agaroza, dừng quá trình điện di.

\r\n\r\n

Để đảm bảo kết quả phân tích có độ\r\ntin cậy cao, cần tiến hành điện di mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu kiểm chứng dương\r\ntính, thang DNA chuẩn, mẫu phân tích.

\r\n\r\n

7.4.4 Nhuộm etidi bromua bảng thạch (chỉ áp dụng cho nhuộm ngoài)

\r\n\r\n

Xem 5.6.5.4.

\r\n\r\n

7.5 Đọc kết quả

\r\n\r\n

7.5.1 Đọc kết quả

\r\n\r\n

7.5.1.1 Đọc kết quả bằng mắt thường: đặt\r\nbảng gel vào máy đọc UV đã được lắp kính chắn. Bật đèn UV. Dưới ánh sáng của\r\ntia UV, các đoạn DNA có etidi bromua chèn giữa 2 mạch sẽ phát quang tạo thành\r\nvạch sáng.

\r\n\r\n

7.5.1.2 Đọc kết quả bằng thiết bị chuyên\r\ndùng (Geldoc): Để bảng gel vào buồng đọc gel và đọc theo chương trình được cài sẳn trong máy tính.\r\n

\r\n\r\n

7.5.2 Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với\r\ncác vạch sáng từ mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính và thang DNA\r\nđể đưa ra kết luận.

\r\n\r\n

7.5.3 Cách đọc kết quả

\r\n\r\n

Đọc kết\r\nquả điện di theo trình tự như sau:

\r\n\r\n\r\n\r\n

8. Diễn giải kết quả

\r\n\r\n

Theo phần\r\ndiễn giải các kết quả, ghi lại phát hiện hoặc không phát hiện virut IHHNV trong\r\nphần mẫu thử.

\r\n\r\n

8.1 Kết quả âm tính

\r\n\r\n

Kết quả\r\nđược coi là âm tính khi:

\r\n\r\n

– phát\r\nhiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

\r\n\r\n

– không\r\nphát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;

\r\n\r\n

– thang\r\nDNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

\r\n\r\n

– mẫu phân\r\ntích không có vạch DNA đích.

\r\n\r\n

8.2 Kết quả dương tính

\r\n\r\n

Kết quả\r\nđược coi là dương tính khi:

\r\n\r\n

– phát\r\nhiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

\r\n\r\n

– không\r\nphát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;

\r\n\r\n

– thang\r\nDNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

\r\n\r\n

– mẫu phân\r\ntích xuất hiện vạch DNA đích.

\r\n\r\n

8.3 Kết quả nghi ngờ

\r\n\r\n

Khi thử\r\nnghiệm cho kết quả nghi ngờ (không phát hiện vạch sáng ở mẫu kiểm chứng dương tính,\r\nphát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính hoặc thang DNA không phân vạch\r\nrõ ràng...), thì phải tiến hành phân tích lại.

\r\n\r\n

9. Báo cáo thử nghiệm

\r\n\r\n

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

\r\n\r\n

– thông tin cần thiết để nhận biết\r\nđầy đủ về mẫu thử;

\r\n\r\n

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng\r\n(nếu có);

\r\n\r\n

– phương pháp thử sử dụng;

\r\n\r\n

– chi tiết thao tác không quy định\r\ntrong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường\r\nkhác có thể ảnh hưởng tới kết quả (nếu có);

\r\n\r\n

– kết quả thử nghiệm thu được;

\r\n\r\n

– báo cáo\r\nkết quả cũng phải nêu rõ nếu các phép thử tiếp theo được thực hiện bởi phòng\r\nthử nghiệm chuẩn, hoặc nếu đã thực hiện thì nêu kết quả thu được.

\r\n\r\n

\r\n\r\n

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n