Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8400-1:2010 do Cục Thú y biên soạn,\r\nBộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất\r\nlượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\nTCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình\r\nchẩn đoán gồm có các phần sau:
\r\n\r\n- TCVN 8400-1:2010 Bệnh động vật -\r\nQuy trình chẩn đoán - Phần 1: Bệnh lở mồm long móng;
\r\n\r\n- TCVN 8400-2:2010 Bệnh động vật -\r\nQuy trình chẩn đoán - Phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;
\r\n\r\n- TCVN 8400-3:2010 Bệnh động vật -\r\nQuy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh giun xoắn;
\r\n\r\n- TCVN 8400-4:2010 Bệnh động vật -\r\nQuy trình chẩn đoán - Phần 4: Bệnh Niu cát xơn.
\r\n\r\nCẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này\r\ncó thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu\r\nchuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc\r\nsử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an\r\ntoàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước\r\nkhi sử dụng tiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn\r\nđoán bệnh lở mồm long móng đối với động vật móng guốc chẵn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ\r\nvà định nghĩa sau:
\r\n\r\nBệnh lở mồm long móng
Bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vật\r\nmóng guốc chẵn như trâu, bò, lợn, dê, cừu và một số động vật hoang dã khác như\r\nhươu, nai. Bệnh do apthovirus thuộc họ Picornaviridae gây nên. Có 7 typ huyết\r\nthanh (serotyp) gồm: A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1. Mỗi serotyp lại có\r\nnhiều subtyp căn cứ vào sự khác biệt về gen và cấu trúc kháng nguyên. Virus gây\r\nbệnh có triệu chứng lâm sàng giống nhau nhưng các serotyp khác nhau không gây\r\nmiễn dịch chéo cho nhau.
\r\n\r\n3. Thuốc thử và vật\r\nliệu thử
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết\r\nphân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết\r\ntương đương không có Rnase, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n- Carbona
- Thuốc thử, Tween 20
\r\n\r\n- Axit clohydric (HC
- Glyxerin [C3H5(OH)3]
\r\n\r\n- Dung dịch TE
\r\n\r\n- Dung dịch TAE 1X.
\r\n\r\n- Agaroza
\r\n\r\n- Etidi bromua (EtBr)
\r\n\r\n- Bộ kit ELISA phát hiện kháng nguyên\r\nlở mồm long móng (Pirbright-UK)
\r\n\r\n- Bộ kit LPB-ELISA phát hiện kháng thể\r\nlở mồm long móng (Pirbright-UK)
\r\n\r\n- Bộ kit FMD-3ABC ELISA phát hiện\r\nkháng thể lở mồm long móng do mắc bệnh tự nhiên
\r\n\r\n- Bộ kit chiết tách ARN
\r\n\r\n- Bộ kít nhân gen RT-PCR
\r\n\r\n- Môi trường tế bào MEM (Modi
- Tế bào dòng BHK-21 (Baby Hamster\r\nkidney) hoặc tế bào thận cừu sơ cấp
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của\r\nphòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Tủ lạnh
\r\n\r\n- Tủ ấm 37 °C
\r\n\r\n- Máy lắc đĩa (orbital shaker)
\r\n\r\n- Máy lắc trộn (vortex\r\nmixer)
\r\n\r\n- Nồi đun cách thủy (
- Máy đọc ELISA với kính lọc 492 nm
\r\n\r\n- Máy rửa đĩa ELISA.
\r\n\r\n- Buồng cấy ATSH cấp II (BSC\r\nll-Bio-safety cabinet)
\r\n\r\n- Máy ly tâm
\r\n\r\n- Máy PCR
\r\n\r\n- Máy Realtime PCR
\r\n\r\n- Bình nón, dung tích 100 ml, 200 ml,\r\n500 ml và 1000 ml.
\r\n\r\n- Ống đong thủy tinh, dung tích 50 ml,\r\n100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml.
\r\n\r\n- Cốc có mỏ các cỡ: 100 ml, 200 ml,\r\n500 ml và 1000 ml
\r\n\r\n- Ống nghiệm
\r\n\r\n- Lọ nhỏ
\r\n\r\n- Máng trộn chất phản ứng (reagent\r\ntrough)
\r\n\r\n- Pipet thủy t
- Micropipet đơn kênh, dung tích từ\r\n0,5 m
- Micropipet đa kênh, dung tích từ 8
- Đầu tip phù hợp với micropipet
\r\n\r\n- Bộ cối chày sứ
\r\n\r\n- Cát sạch để nghiền bệnh phẩm
\r\n\r\n- Khăn bông
\r\n\r\n- Dao, kéo, panh kẹp.
\r\n\r\n\r\n\r\nBệnh phẩm để phát hiện virus hoặc\r\nkháng nguyên là tổ chức biểu mô của mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ và dịch mụn nước.\r\nMẫu bệnh phẩm biểu mô tối thiểu là 2 g. Bệnh phẩm sau khi lấy được bảo quản\r\ntrong dung dịch đệm PBS 0,04 M có Glyxerin, pH từ 7.2 đến 7.6 ở nhiệt độ -20\r\n°C. Mẫu biểu mô và mụn nước để phát hiện kháng nguyên thì trong vòng 7 ngày kể\r\ntừ khi phát hiện bệnh còn sau 7 ngày nên lấy mẫu huyết thanh để phát hiện kháng\r\nthể, máu được lấy vô trùng, lượng tối thiểu là 3 ml, để đông, chắt lấy huyết\r\nthanh. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Nên lấy ít nhất là 5 mẫu.
\r\n\r\nMẫu sau khi lấy được giữ trong điều kiện\r\nlạnh, bao gói cẩn thận để không làm lây lan bệnh rồi chuyển tới phòng xét nghiệm\r\ncàng sớm càng tốt để có kết quả xét nghiệm chính xác.
\r\n\r\n\r\n\r\n6.1. Chẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n6.1.1. Dịch tễ học
\r\n\r\nBệnh lở mồm long móng gây thành dịch ở\r\nnhiều loài động vật móng gốc chẵn, chủ yếu ở trâu bò và lợn. Sự nhiễm khuẩn qua\r\nnhiều con đường nhưng chủ yếu là qua không khí.
\r\n\r\nBệnh do nhiều typ và tiểu typ của\r\nAphthovirus gây ra. Các typ huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới.\r\nTyp huyết thanh O, A được nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới. Trái\r\nlại các typ huyết thanh SAT1, SAT2, SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc châu\r\nPhi. Typ huyết thanh Asia 1 được tìm thấy ở nhiều nước thuộc châu Á.
\r\n\r\nTrong các ổ dịch, động vật có thể mắc\r\nbệnh do một hoặc cùng một lúc nhiều typ. Bệnh có tính chất lây lan nhanh, mạnh,\r\nrộng đối với động vật mẫn cảm.
\r\n\r\nBệnh có thể lây trực tiếp từ động vật\r\nmắc bệnh đến động vật mẫn cảm, hay lây gián tiếp qua sản phẩm động vật (thịt, sữa,\r\ntinh dịch, da..), dụng cụ chăn nuôi, vận chuyển gia súc...
\r\n\r\n6.1.2. Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nỞ trâu bò và lợn hoặc các loài vật\r\nkhác đều có chung đặc điểm là sốt đột ngột trong khoảng từ 2 ngày đến 3 ngày,\r\nviêm mụn nước rồi lở loét ở miệng, vú, vùng móng chân, nước bọt chảy nhiều như\r\nbọt bia. Niêm mạc miệng, môi, lợi, chân răng đỏ ửng, khô, nóng. Mụn nước bắt đầu\r\nmọc ở bên trong má, mép, chân răng, môi, lợi, và bề mặt lưỡi. Kích thước mụn bằng\r\nhạt gạo, hạt ngô hoặc to hơn. Mụn nước phồng lên, có màng bọc mỏng, bên trong\r\nchứa nước trong, sau đục dần. Sau 1 ngày đến 2 ngày, mụn nước bị vỡ, lớp niêm mạc\r\ntróc ra để lộ mặt dưới đỏ, chạm nhẹ vào dễ chảy máu. Mụn nước thường không có mủ.\r\nNước bọt sùi ra đầy mõm miệng, chảy lòng thòng thành sợi dài.
\r\n\r\nDo có viêm mụn nước ở vùng vành móng,\r\nkẽ móng chân làm con vật khó chịu, tỏ ra đau đớn, bồn chồn, luôn nhấc chân lên.\r\nDễ thấy nhất là hiện tượng què trong khoảng 1 tuần đến 2 tuần. Có trường hợp\r\nmóng chân bị long hẳn ra, phổ biến nhất là ở lợn.
\r\n\r\nỞ con vật cái đang nuôi con, triệu chứng\r\nở bầu vú, núm vú cũng tương tự như ở miệng và chân làm con vật giảm tiết sữa, sữa\r\nbị giảm phẩm chất. Con mẹ thường không cho con bú vì đau, làm con non thiếu sữa.\r\nHơn nữa chính con non cũng bị viêm lở mồm như mẹ nên không bú được. Hậu quả có\r\ntới 50 % đến 80 % gia súc non bị chết. Con vật mang thai dễ bị sẩy thai.
\r\n\r\nBiến chứng: Viên cơ tim ở súc vật non\r\nvà viêm ruột (bê non, lợn dưới 2 tháng).
\r\n\r\n6.1.3. Giải phẫu bệnh học
\r\n\r\nMổ khám bệnh tích chủ yếu là từ miệng\r\ntới thực quản, dạ dày, ruột đều có mụn loét với từng mảng xuất huyết hoặc tụ\r\nmáu. Bộ máy hô hấp cũng bị viêm. Có mụn nước ở mồm (niêm mạc môi, lợi, lưỡi và vòm\r\nmiệng), mũi, kẽ móng, viền móng và núm vú. Mụn nước vỡ có thể thành vết loét,\r\nchảy máu.
\r\n\r\nLưỡi trâu, bò thường bị bong tróc biểu\r\nmô 2/3 phía trước, móng bị tụt, mặt ngoài tim có những vệt hoại tử màu trắng\r\nxen kẽ trông giống như da hổ nên gọi là “tim vằn hổ”.
\r\n\r\n6.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
\r\n\r\n6.2.1. Phát hiện kháng nguyên
\r\n\r\n6.2.1.1. Xử lý bệnh phẩm
\r\n\r\nMẫu bệnh phẩm là biểu mô của mụn nước\r\nđược nghiền trong cối chày sứ với dung dịch PBS 0,04 M tỷ lệ 1:10. Ly tâm huyễn\r\ndịch bệnh phẩm 2000 r/min trong 10 min. Hút lấy dịch nước trong ở phía trên rồi\r\ncho dung dịch kháng khuẩn vào ( 0,01 ml/ 1ml huyễn dịch, xem Phụ lục A) lắc đều\r\ntrong 15 min đến 20 min rồi tiến hành làm phản ứng ELISA, RT-PCR (rRT-PCR) hoặc\r\nphân lập trên tế bào.
\r\n\r\n6.2.1.2. Phương pháp ELISA phát hiện\r\nkháng nguyên
\r\n\r\n6.2.1.2.1. Nguyên tắc
\r\n\r\nPhản ứng Sandwich ELISA gián tiếp có\r\nthể phát hiện nhiều typ kháng nguyên (O, A, C và Asia 1). Phản ứng được thực hiện\r\ntrên đĩa đáy bằng, 96 lỗ (Nunc, Maxisorp).
\r\n\r\n6.2.1.2.2. Các bước tiến hành
6.2.1.3. Phương pháp RT-PCR và rRT-PCR
\r\n\r\n6.2.1.3.1. Nguyên tắc
\r\n\r\nPhản ứng chuỗi polyme phiên mã ngược\r\ndùng để phát hiện ARN của virus lở mồm long móng. Hiện nay phản ứng RT-PCR có\r\nthể phát hiện và định typ của virus lở mồm long móng, còn phản ứng rRT- PCR chỉ\r\ncho phép phát hiện virus lở mồm long móng.
\r\n\r\n6.2.1.3.2. Các bước tiến hành
- Chiết tách ARN bằng kit theo hướng dẫn\r\ncủa nhà sản xuất
\r\n\r\n- Chạy RT-PCR hoặc Realtime RT-PCR
\r\n\r\n6.2.1.4. Phân lập virus trên môi trường\r\ntế bào
\r\n\r\nDùng tế bào dòng BHK-21 hoặc tế bào thận\r\ncừu sơ cấp.
\r\n\r\nNhiễm huyễn dịch bệnh phẩm 1 ml/ chai\r\ntế bào (T25).
\r\n\r\nỦ ở nhiệt độ 37 °C trong 60 min, sau\r\nđó cho dung dịch MEM (Eagle’s) không có huyết thanh nuôi tiếp.
\r\n\r\nHàng ngày kiểm tra bệnh tích tế\r\nbào-cytopathogen effect (CPE): Nếu tới 48 h có CPE xuất hiện thì thu hỗn dịch tế\r\nbào, ly tâm 2000 g/min trong 15 min. Lấy dịch nổi giám định virus. Nếu sau 48 h\r\nkhông có CPE thì thu hỗn dịch tế bào và cấy chuyển tiếp, sau 3 lần không có CPE\r\nthì mẫu được coi là âm tính (không có virus lở mồm long móng).
\r\n\r\nGiám định virus phân lập:
\r\n\r\nSử dụng phương pháp ELISA phát hiện\r\nkháng nguyên.
\r\n\r\nSử dụng phương pháp RT-PCR phát hiện\r\nARN virus.
\r\n\r\n6.2.2. Phát hiện kháng thể
\r\n\r\nPhát hiện kháng thể lở mồm long móng\r\ndùng để chẩn đoán trong trường hợp gia súc mắc bệnh có triệu chứng của bệnh lở mồm\r\nlong móng, chưa bao giờ tiêm phòng vắc xin lở mồm long móng.
\r\n\r\n6.2.2.1. Phương pháp ELISA FMD-3ABC,
6.2.2.1.1. Nguyên tắc
\r\n\r\nGia súc nhiễm bệnh lở mồm long móng sẽ\r\nsản sinh kháng thể kháng protein không cấu trúc (3ABC), trong khi gia súc khỏe\r\nmạnh, chưa bao giờ nhiễm bệnh được tiêm phòng vắc xin lở mồm long móng tinh khiết\r\nkhông có kháng thể này.
\r\n\r\n6.2.2.1.2. Các bước tiến hành:
6.2.2.2. Phương pháp Liquid\r\nphase blocking ELISA:
\r\n\r\n6.2.2.2.1. Nguyên tắc
\r\n\r\nSử dụng bộ kit ELISA phát hiện kháng\r\nthể lở mồm long móng ở gia súc. Dùng để định typ virus nếu gia súc chưa bao giờ\r\ntiêm phòng mà có kháng thể lở mồm long móng tự nhiên dương tính và có thể dùng\r\nđể đánh giá hiệu giá kháng thể sau khi tiêm phòng vắc xin lở mồm long móng. Dựa\r\ntrên nguyên tắc phản ứng Sandwich ELISA gián tiếp phát hiện và định typ huyết\r\nthanh của kháng thể lở mồm long móng. Phản ứng thực hiện trên đĩa đáy bằng, 96\r\nlỗ (Nunc, Maxisorp).
\r\n\r\n6.2.2.2.2. Các bước tiến hành
6.2.3. Chẩn đoán phân biệt với một số\r\nbệnh
\r\n\r\n- Bệnh viêm miệng có mụn nước (vesicular stomatitis)
\r\n\r\n- Bệnh mụn nước ở lợn (swine vesicular disease)
\r\n\r\n- Bệnh ngoại ban mụn nước (vesicular exanthema)
\r\n\r\n\r\n\r\nGia súc được xác định mắc bệnh lở mồm\r\nlong móng khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh lở mồm\r\nlong móng và kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:
\r\n\r\n- Phản ứng ELISA phát hiện kháng\r\nnguyên dương tính.
\r\n\r\n- Phản ứng RT-PCR phát hiện virus\r\ndương tính.
\r\n\r\n- Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể\r\ndương tính ở gia súc chưa tiêm phòng.
\r\n\r\n- Phương pháp ELISA FMD-3ABC phát hiện\r\nkháng thể kháng virus lở mồm long móng do nhiễm tự nhiên dương tính.
\r\n\r\n- Phân lập được virus trên môi trường\r\ntế bào, và giám định virus lở mồm long móng dương tính.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1. Dung dịch bảo quản
\r\n\r\n- PBS 0,04 M:
\r\n\r\n| \r\n Na2HPO | \r\n \r\n 3,05 g \r\n | \r\n
| \r\n KH2 | \r\n \r\n 0,39 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước cất \r\n | \r\n \r\n 500 ml \r\n | \r\n
| \r\n Đỏ phenol 1 % \r\n | \r\n \r\n 1 ml \r\n | \r\n
- Kháng sinh:
\r\n\r\n| \r\n Penicilline \r\n | \r\n \r\n 1000 UI/ml \r\n | \r\n
| \r\n Mycostatine \r\n | \r\n \r\n 100 UI/ml \r\n | \r\n
| \r\n Neomycine \r\n | \r\n \r\n 100 UI/ml \r\n | \r\n
| \r\n Polymicine \r\n | \r\n \r\n 50 UI/ml \r\n | \r\n
Sau khi pha kiểm tra pH từ 7,2 đến 7,6\r\nchỉnh pH với NaOH 1 N hoặc HC 1 N
\r\n\r\nChú ý: Khi dùng pha dung dịch bảo quản\r\nvới glyxerin tỷ lệ 1:1
\r\n\r\nA.2. Dung dịch đệm
\r\n\r\nDung dịch đệm carbonat/bicarbonat dung\r\ndịch đệm 0,05 M, pH 9,6
\r\n\r\n| \r\n NaHCO | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Na2 | \r\n \r\n | \r\n
A.3
| \r\n Na2HP | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n KH2 | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n NaCl \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n KCl \r\n | \r\n \r\n | \r\n
A.4
| \r\n Na2HPO | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n KH2PO4 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n NaCl \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n KCl \r\n | \r\n \r\n | \r\n
A.5. Dung dịch đệm B: PBS 0,01 M +\r\n0,05 % Tween 20 + 5 % sữa bột tách bơ, pH từ 7,2 đến 7,6
\r\n\r\n| \r\n Na2HP | \r\n \r\n 1,21 | \r\n
| \r\n KH2 | \r\n \r\n 0,20 | \r\n
| \r\n NaCl \r\n | \r\n \r\n 8,00 g/l \r\n | \r\n
| \r\n KCl \r\n | \r\n \r\n 0,20 g/l \r\n | \r\n
A.6
Hòa tan kháng sinh bằng nước cất rồi lọc\r\nmàng lọc cỡ lỗ 0,45 mm,\r\nbảo quản ở ngăn đá tủ lạnh.
\r\n\r\n| \r\n Penicilline \r\n | \r\n \r\n 1.000.000 UI \r\n | \r\n
| \r\n Mycostatine \r\n | \r\n \r\n 250.000 UI \r\n | \r\n
| \r\n Streptomycine \r\n | \r\n \r\n 200 mg \r\n | \r\n
| \r\n Kanamicine \r\n | \r\n \r\n 1.000.000 UI \r\n | \r\n
| \r\n Nước cất vô trùng \r\n | \r\n \r\n 10 ml \r\n | \r\n
A.7
- Mồi đông khô phải được ly tâm ngắn để\r\nchắc chắn rằng mồi được lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu\r\ntiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/
- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 pmol/
| \r\n Mồi gốc \r\n | \r\n \r\n 10 | \r\n
| \r\n Nước không chứa RNAse \r\n | \r\n \r\n 90 ml \r\n | \r\n
| \r\n Tổng lượng \r\n | \r\n \r\n 100 ml \r\n | \r\n
B.1. Cách tiến hành
\r\n\r\n- Gắn đĩa (coating): Kháng huyết thanh\r\nthỏ kháng virus lở mồm long móng của các typ O, A, C và Asia 1 pha loãng 1:1000\r\nvới dung dịch coating dung dịch đệm (Phụ lục A), nhỏ 50 ml vào các giếng tương\r\nứng. Đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt độ 37 °C/1 h hoặc ủ qua đêm ở 4 °C.
\r\n\r\n- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS\r\n0,002M.
\r\n\r\n- Nhỏ 50 ml kháng nguyên đối chứng\r\ndương tính mạnh (1:10) và yếu (1:100) pha loãng bằng dung dịch đệm A (Phụ lục\r\nA) và mẫu bệnh phẩm vào các giếng quy định (Phụ lục B), ủ và lắc ở nhiệt độ 37\r\n°C/1 h.
\r\n\r\n- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002M\r\n(Phụ lục A)
\r\n\r\n- Nhỏ kháng thể phát hiện: Mỗi giếng\r\nnhỏ 50 m
- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS\r\n0,002 M (Phụ lục A)
\r\n\r\n- Nhỏ chất gắn kết (1:200 pha với dung\r\ndịch đệm B): 50 m
Đậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt độ 37 °C/40\r\nmin.
\r\n\r\n- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS\r\n0,002 M (Phụ lục A)
\r\n\r\n- Nhỏ cơ chất chromogen (dung dịch\r\nchromogen + 5 % cơ chất): 50 ml/giếng, để 20 min ở nhiệt độ phòng, chỗ tối.
\r\n\r\n- Dừng phản ứng: nhỏ dung dịch H2SO4\r\n1,25 M với 50 m
B.2. Đọc kết quả
\r\n\r\nĐọc bằng máy đọc ELISA có kính lọc 492\r\nnm. Nếu giá trị OD > 0,1 sau khi đã trừ đi giá trị trung bình của cột trắng\r\nthì phản ứng được coi là dương tính với serotyp đó.
\r\n\r\nNếu OD = 0,1 thì cấy chuyển mẫu bệnh\r\nphẩm lên môi trường tế bào rồi kiểm tra lại.
\r\n\r\n![](\"00912179_files/image001.gif\")
C.1. Chiết tách ARN
\r\n\r\nTheo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nC.2. Tiến hành phản ứng RT-PCR
\r\n\r\nC.2.1. Công thức
\r\n\r\nÁp dụng cho kit RT-PCR 1 bước của hãng\r\nQiagen (nếu dùng kit khác có thể phải thay đổi công thức pha chế)
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n H2O \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 5X Dung dịch đệm \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n dNTP \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hỗn hợp enzym \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi xuôi \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi ngược \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu ARN \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tổng cộng \r\n | \r\n \r\n | \r\n
\r\n\r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
C.2.2. Chu trình nhân gen
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
C.2.3. Chạy điện di
\r\n\r\n- Chuẩn bị thạch Agaroza 2 % pha trong\r\ndung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X có Etidi bromua (10 μg/μl).
\r\n\r\n- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).
\r\n\r\n- Thạch khô, rút lược ra và cho mẫu\r\nvào các giếng (8 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch loading dung dịch đệm).
\r\n\r\n- Sử dụng Marker trọng lượng phân tử (thang 100\r\nbp).
\r\n\r\n- Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối\r\nchứng dương và đối chứng âm đi kèm (mẫu đối chứng âm có thể là nước cất sạch).
\r\n\r\nC.2.4. Đọc kết quả
\r\n\r\n- Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch và có\r\nkích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương
\r\n\r\n- Mẫu âm tính: Không có vạch.
\r\n\r\nC.2.5. Đánh giá kết quả
\r\n\r\nCó virus Lở mồm long móng ở trong mẫu\r\nbệnh phẩm nếu kết quả PCR dương tính.
\r\n\r\nC.3. Phương pháp Realtime RT-PCR: sử dụng\r\nmồi và probe
\r\n\r\nC.3.1. Công thức
\r\n\r\nÁp dụng cho kit RT-PCR 1 bước của hãng Qiagen\r\n(nếu dùng kit khác có thể phải thay đổi công thức pha chế).
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n H2O \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Dung dịch đệm 5X \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n MgCl2 | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n dNTP \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hỗn hợp enzym \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi xuôi (20 mM) \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi ngược (20 mM) \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Probe (6 mM) \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu ARN \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tổng cộng \r\n | \r\n \r\n | \r\n
\r\n\r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n AGATGCAGGARGACATGTCAA \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n TTGTACCAGGGYTTGGCYT \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n AAACACGGACCCGACTTTAACCG \r\n | \r\n
C.3.2. Chu trình nhân gen
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước phiên mã ngược \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n Bước biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bắt cặp \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
C.3.3. Đọc kết quả
\r\n\r\n- Mẫu dương tính: Khi 35 ≥Ct≥20.
\r\n\r\n- Mẫu âm tính: Khi không có Ct.
\r\n\r\n- Mẫu nghi ngờ: Khi 40≥Ct≥35.
\r\n\r\nC.3.4. Đánh giá kết quả
\r\n\r\nCó virus lở mồm long móng ở trong mẫu\r\nbệnh phẩm nếu kết quả đồ thị Realtime RT- PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ\r\ncần làm lại.
\r\n\r\nC.4. Định typ virus lở mồm long móng:\r\nsử dụng mồi typ O, A, Asia1 của Pirbright
\r\n\r\nC.4.1. Công thức
\r\n\r\nÁp dụng cho kit RT-PCR 1 bước của hãng\r\nQiagen (nếu dùng kit khác có thể phải thay đổi công thức pha chế)
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n H2O \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 5X Dung dịch đệm \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n dNTP \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hỗn hợp enzym \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi xuôi \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi ngược \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu ARN \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tổng cộng \r\n | \r\n \r\n | \r\n
C.4.2. Chu trình nhân gen
\r\n\r\n| \r\n Bước \r\n | \r\n \r\n Chu kỳ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước 1 \r\n | \r\n \r\n 1 chu kỳ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước 2 \r\n | \r\n \r\n 1 chu kỳ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước 3 \r\n | \r\n \r\n 1 chu kỳ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n 20 chu kỳ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n Bước 4 \r\n | \r\n \r\n 1 chu kỳ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước 5 \r\n | \r\n \r\n 1 chu kỳ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Quy trình nhân gen này áp dụng cho mồi\r\ntyp O, A, Asia1 của Pirbright, đối với các cặp mồi khác quy trình có thể thay đổi\r\ncho phù hợp.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
C.4.3. Chạy điện di
\r\n\r\n- Chuẩn bị thạch Agaroza 2 % pha trong\r\ndung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X có Etidi bromua (10 mg/
- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).
\r\n\r\n- Thạch khô, rút lược ra và cho mẫu vào\r\ncác giếng (8m
- Sử dụng Marker trọng lượng phân tử (thang 100\r\nbp).
\r\n\r\n- Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối\r\nchứng dương và đối chứng âm đi kèm (mẫu đối chứng âm có thể là nước cất sạch).
\r\n\r\nC.4.4. Đọc kết quả
\r\n\r\n- Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch và có\r\nkích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương
\r\n\r\n- Mẫu âm tính: Không có vạch.
\r\n\r\nC.4.5. Đánh giá kết quả
\r\n\r\nVirus lở mồm long móng ở trong mẫu bệnh\r\nphẩm thuộc typ gì tùy thuộc kết quả chạy điện di dương tính ở loại mồi nào.
\r\n\r\n\r\n\r\n
D.1. Cách tiến hành
\r\n\r\nGắn đĩa (coating): Kháng huyết thanh\r\nthỏ kháng virus lở mồm long móng đã pha loãng 1:1000 với coating dung dịch đệm,\r\nnhỏ 50 m
Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên-huyết\r\nthanh (liquid phase blocking), nhỏ vào đĩa nhựa polypropylen 96 giếng\r\nđáy chữ U (Phụ lục A):
\r\n\r\n- Huyết thanh đối chứng và kiểm tra được\r\npha loãng 1:16 với dung dịch đệm A, 50 ml/giếng.
\r\n\r\n- Kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ\r\ncho trước, 50 m
Hỗn hợp được ủ qua đêm ở 4 °C.
\r\n\r\nRửa đĩa ELISA 3 lần bằng dung dịch rửa\r\nPBS 0,002 M (Phụ lục A)
\r\n\r\nChuyển 50
Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002M\r\n(Phụ lục A)
\r\n\r\nNhỏ kháng thể phát hiện: Kháng huyết\r\nthanh chuột lang kháng virus lở mồm long móng pha loãng 1:100 với dung dịch đệm\r\nB, 50 m
Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002\r\nM (Phụ lục A)
\r\n\r\nNhỏ chất gắn kết: pha loãng 1:200 với\r\ndung dịch đệm B, 50 ml/giếng.\r\nĐậy nắp, ủ và lắc ở nhiệt độ 37 °C/40 min.
\r\n\r\nRửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,002\r\nM (Phụ lục A)
\r\n\r\nNhỏ cơ chất chromogen (dung dịch\r\nchromogen + 5 % cơ chất): 50 ml/giếng, để 20 min ở nhiệt độ phòng, chỗ tối.
\r\n\r\nDừng phản ứng: nhỏ 50
D.2. Đọc kết quả
\r\n\r\nSử dụng máy đọc ELISA, kính lọc 492\r\nnm. Sử dụng phần mềm edi để tính PI (phần trăm ức chế). Nếu PI ≥ 50 thì mẫu được\r\ncoi là dương tính, trong huyết thanh có kháng thể lở mồm long móng.
\r\n\r\nSơ đồ đĩa ELISA phát hiện kháng thể được\r\ntrình bày ở Phụ lục D.
\r\n\r\nCHÚ Ý: Xác định hiệu giá kháng thể, mẫu\r\nhuyết thanh được pha như sau:
\r\n\r\n- Huyết thanh kiểm tra: Pha lo
- Nhỏ dung dịch dung dịch đệm A: 50
- Nhỏ huyết thanh kiểm tra đã pha\r\nloãng 1:8 vào các lỗ tương ứng 50 ml/giếng và pha loãng theo cơ số 2 từ hàng A đến hàng D và\r\ntừ hàng E đến hàng H.
\r\n\r\n- Huyết thanh đối chứng: Chuẩn bị giống\r\nphát hiện kháng thể
\r\n\r\n- Nhỏ kháng nguyên đã pha loãng theo tỷ\r\nlệ cho trước 50 m
- Hỗn hợp kháng nguyên-huyết thanh được\r\nủ qua đêm ở 4 °C.
\r\n\r\n- Các bước sau tiến hành theo trình tự\r\ngiống phản ứng ELISA phát hiện kháng thể.
\r\n\r\nSơ đồ đĩa phản ứng ELISA
\r\n\r\n![](\"00912179_files/image002.gif\")
![](\"00912179_files/image003.gif\")
CHÚ THÍCH
C+
C
Ca: đối chứng kháng\r\nnguyên
\r\n\r\nCông thức tính P
\r\n\r\n
[1] Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông\r\nthôn - Cục Thú y, 2006. Tiêu chuẩn, quy trình ngành thú y, Quy trình chẩn\r\nđoán bệnh Dịch tả lợn /10 TCN 717-2006, trang 270-282
\r\n\r\n[2] O.I.E., 2009. Manual of Diagnostic\r\nTests and Vaccines for Terrestrial Animals, Foot and Mouth Disease,\r\nchapter 2.1.5
\r\n\r\n[3] Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông\r\nthôn - Viện Thú y, 2002. Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt\r\nNam, in lần thứ nhất, bệnh Lở mồm Long móng, trang 32-33.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2010 về Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán – Phần 1: Bệnh lở mồm long móng đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2010 về Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán – Phần 1: Bệnh lở mồm long móng
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8400-1:2010 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2010-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |