CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này\r\ncó thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm.\r\nTiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn\r\nliên quan đến việc sử dụng chúng. Các phòng thí nghiệm sử dụng tiêu chuẩn\r\nnày phải tự thiết lập các nguyên tắc bảo đảm an toàn sinh học để không phải bị\r\nnhiễm bệnh nghề nghiệp hoặc thất thoát các mầm bệnh từ phòng thí nghiệm ra\r\nmôi trường.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\ndịch tả đối với vịt, ngan và ngỗng.
\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ, định\r\nnghĩa và chữ viết tắt sau:
\r\n\r\n2.1 Thuật ngữ và định nghĩa
\r\n\r\nBệnh dịch tả vịt (duck virus enteritis\r\ndisease)
\r\n\r\nBệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm xảy ra ở\r\nvịt, ngan, ngỗng các lứa tuổi, do Herpesvirus gây nên, gây viêm niêm mạc\r\nđường tiêu hóa và ỉa chảy.
\r\n\r\n2.2 Chữ viết tắt
\r\n\r\n- PCR: Polymerase Chain Reaction (phản ứng\r\nchuỗi polyme)
\r\n\r\n- Realtime PCR: Realtime Polymerase Chain\r\nReaction (phản ứng chuỗi polyme tức thì)
\r\n\r\n- DVE (DP): Duck Virus Enteritis Disease\r\n(Duck plague) (Bệnh dịch tả vịt)
\r\n\r\n- VN: Virus Neutralization (Phản ứng trung\r\nhòa vi rút với kháng thể chuẩn)
\r\n\r\n- SN: Serum Neutralization (Phản ứng trung\r\nhòa huyết thanh với vi rút giống chuẩn)
\r\n\r\n- CPE: Cytopathologic Effects (Bệnh tích tế\r\nbào)
\r\n\r\n- FCS: Fetal Calf Serum (Huyết thanh bào thai\r\nbê)
\r\n\r\n- DEF: Duck Embryo Fibroblast (Tế bào xơ phôi\r\nvịt)
\r\n\r\n- NI: Neutralization Index (Chỉ số trung hòa)
\r\n\r\n- EID50: Embryo Infective\r\nDosage, 50 % (Liều gây nhiễm 50 % phôi trứng)
\r\n\r\n- ELD50: Embryo Lethal\r\nDosage, 50 % (Liều gây chết 50 % phôi trứng)
\r\n\r\n- TCID50: Tissue Culture Infective\r\nDosage, 50 % (Liều gây nhiễm 50 % tế bào)
\r\n\r\nSử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích\r\nvà nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương\r\nkhông có Dnase/Rnase, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\nXem Phụ lục A về mô tả các môi trường và dung\r\ndịch thuốc thử. - Cồn 70 %
\r\n\r\n- Cồn 96 % đến 100 %
\r\n\r\n- Giống vi rút dịch tả vịt
\r\n\r\n- Kháng huyết thanh chuẩn kháng vi rút dịch tả\r\nvịt
\r\n\r\n- Mồi (primers) và mẫu dò (probe) đặc hiệu
\r\n\r\n- Kit chiết tách ADN
\r\n\r\n- Kit PCR, realtime PCR
\r\n\r\n- Phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày\r\ntuổi
\r\n\r\n- Phôi trứng vịt từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày\r\ntuổi.
\r\n\r\n\r\n\r\n- Tủ lạnh thường
\r\n\r\n- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 oC
\r\n\r\n- Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ từ\r\n100 oC đến 200 oC - Tủ ấp trứng
\r\n\r\n- Đèn soi trứng
\r\n\r\n- Nồi hấp ướt.
\r\n\r\n- Máy ly tâm, có thể hoạt động được ở gia tốc\r\n2000 g
\r\n\r\n- Máy ly tâm ống nhỏ, có thể hoạt động được ở\r\ngia tốc 20000 g - Máy realtime PCR
\r\n\r\n- Micropipet đơn kênh, dung tích hút từ\r\n0,5 m
- Micropipet đa kênh (dùng pha loãng), dung\r\ntích hút từ 5 m
- Ống lấy máu, dung tích 10 ml
\r\n\r\n- Ống Eppendorf, dung tích từ 1,5 ml đến 2 ml\r\n- Bơm tiêm, dung tích 1 ml, 2 ml, 5 ml
\r\n\r\n- Bộ cối chày sứ, có đường kính 6 cm
\r\n\r\n- Dụng cụ dao, kéo, panh, kẹp, bông...
\r\n\r\n- Buồng đếm tế bào Neubauer
\r\n\r\n- Chai nuôi tế bào T25, T75
\r\n\r\n- Đĩa nuôi tế bào 6 giếng, 24 giếng, 96 giếng.
\r\n\r\n\r\n\r\n5.1 Chẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n5.1.1 Đặc điểm dịch tễ
\r\n\r\nBệnh dịch tả vịt là bệnh truyền nhiễm cấp\r\ntính, lây lan cho vịt, ngan, ngỗng mọi lứa tuổi.
\r\n\r\nBệnh lây lan nhanh và trầm trọng trong khoảng\r\n2 ngày đến 3 ngày.
\r\n\r\nBệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp\r\ngiữa các vịt khỏe mạnh và vịt bị nhiễm bệnh. Bệnh truyền qua phân gia cầm mắc bệnh\r\nvà các dịch tiết từ mũi, miệng và mắt.
\r\n\r\nBệnh lây lan nhanh và có thể lây lan dễ dàng\r\nbằng phương tiện cơ học như giày dép và quần áo mang từ một đàn bị nhiễm đến.
\r\n\r\nBệnh dịch tả vịt có tỷ lệ ốm và chết cao, có\r\nthể từ 70 % đến 80 % nếu bị nhiễm lần đầu ở trại không tiêm phòng vacxin dịch tả\r\nvịt thường xuyên, kết hợp với vệ sinh không đảm bảo.
\r\n\r\n5.1.2 Triệu chứng và bệnh tích
\r\n\r\nThời gian ủ bệnh thường từ 2 ngày đến 4 ngày\r\ntùy theo độc lực của vi rút.
\r\n\r\nVịt, ngan, ngỗng bị bệnh có hiện tượng giảm\r\năn, mất thăng bằng, phân loãng, xù lông, chảy nước mũi, mắt có dử, mí mắt\r\nsưng. Con vật sợ ánh sáng.
\r\n\r\nTuỳ theo trường hợp có thể thấy một hoặc nhiều\r\ntrong những bệnh tích sau:
\r\n\r\n- Ở vịt trưởng thành có hiện tượng gan bị bạc\r\nmàu hoặc xuất huyết điểm. Con cái có thể thấy các nang trứng bị xuất huyết.
\r\n\r\n- Mạch máu bị tổn thương. Hệ bạch huyết bị tổn\r\nthương và thoái hóa nhu mô.
\r\n\r\n- Đường tiêu hóa bị viêm, ruột xuất huyết\r\nthành từng mảng, có nhiều chất nhờn. Đây là bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch\r\ntả vịt.
\r\n\r\n- Kiểm tra vi thể thấy tổn thương mạch máu và\r\ncác cơ quan phủ tạng. Xuất hiện các thể vùi nội nhân, thể vùi tế bào chất\r\ntrong các tể bào biểu mô của hệ thống tiêu hóa. Đây là biến đổi vi thể điển\r\nhình của bệnh.
\r\n\r\n5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm
\r\n\r\n5.2.1 Lấy mẫu và bảo quản
\r\n\r\n- Lấy mẫu vào thời kỳ đầu của ổ dịch. Lấy\r\nngay sau khi con vật ốm, chết hoặc mổ khám. Lấy mẫu theo quy trình tại TCVN\r\n8402:2010 Chẩn đoán bệnh động vật Quy trình mổ khám.
\r\n\r\n- Mẫu bệnh phẩm là gan, lách, thận. Nếu là\r\ncon vật bệnh hoặc xác mới chết phải lấy từ 3 con đến 5 con. Bệnh phẩm là\r\nhuyết thanh để phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt, huyết thanh được lấy\r\nsau 10 ngày từ khi dịch bệnh xảy ra, hoặc nếu vịt đã tiêm phòng thì lấy sau khi\r\ntiêm 1 tháng để kiểm tra kháng thể bảo hộ.
\r\n\r\n- Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng\r\nbệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong\r\nđiều kiện lạnh từ 2 oC đến 8 oC. Mẫu bệnh phẩm\r\ngửi đến phòng xét nghiệm trong vòng 24 h, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm.
\r\n\r\n5.2.2 Xử lý bệnh phẩm
\r\n\r\nBệnh phẩm là phủ tạng lấy từ gia cầm chết, bệnh\r\nnghi nhiễm dịch tả vịt được nghiền thành huyễn dịch 10 % với dung dịch nước\r\nsinh lý hoặc PBS. Sau đó ly tâm với gia tốc 1000g trong 10 min. Thu lấy dịch nổi,\r\nxử lý vô trùng bằng kháng sinh (2000 UI/ml) hoặc lọc qua màng cỡ 0,45 µm. Huyễn\r\ndịch bệnh phẩm đã xử lý có thể dùng để chẩn đoán phát hiện vi rút dịch tả\r\nvịt bằng phản ứng Realtime PCR hoặc phân lập vi rút trên phôi trứng vịt.
\r\n\r\nBệnh phẩm là máu được giữ ở 4 oC đến\r\n8 oC chờ đông rồi chắt lấy huyết thanh để chẩn đoán phát hiện kháng\r\nthể kháng vi rút dịch tả vịt.
\r\n\r\n5.2.3 Phát hiện kháng nguyên
\r\n\r\n5.2.3.1 Phân lập và giám định vi rút trên\r\nphôi trứng vịt
\r\n\r\nSử dụng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12\r\nngày tuổi để tiêm truyền huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý theo 5.2.2. Thu hoạch\r\ndịch niệu mô để giám định vi rút bằng phương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn\r\ntrên phôi trứng vịt theo quy định tại Phụ lục B.
\r\n\r\n5.2.3.2 Phân lập và giám định vi rút trên tế\r\nbào xơ phôi vịt
\r\n\r\nSử dụng tế bào xơ phôi vịt (DEF) để gây nhiễm\r\nbằng huyễn dịch bênh phẩm. Thu hoạch dịch nuôi tế bào và giám định vi rút\r\nbằng phương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn trên môi trường tế bào\r\nDEF theo quy định tại Phụ lục C.
\r\n\r\n5.2.3.3. Kỹ thuật PCR phát hiện vi rút
\r\n\r\n- Chiết tách ADN của vi rút dịch tả vịt bằng\r\nbộ kít chiết tách.
\r\n\r\n- Làm phản ứng PCR và điện di sản phẩm PCR.\r\nHoặc làm phản ứng realtime PCR theo quy định tại Phụ lục D.
\r\n\r\n5.2.4 Phát hiện kháng thể
\r\n\r\nCó thể phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch\r\ntả vịt trong huyết thanh vịt mắc bệnh hoặc đã được tiêm phòng vắc xin bằng\r\nphương pháp trung hòa huyết thanh với vi rút dịch tả vịt rồi tiêm trên phôi trứng\r\nvịt hoặc trên tế bào xơ phôi vịt.
\r\n\r\n5.2.4.1 Phương pháp trung hòa huyết thanh\r\ntrên phôi trứng vịt
\r\n\r\nPha loãng huyết thanh cần phát hiện kháng thể\r\nthành các nồng độ 1/5, 1/10, 1/20… 1/1280. Trung hòa huyết thanh với liều 1000\r\nELD50 (hoặc 100 EID50) vi rút dịch tả vịt.
\r\n\r\nTiêm hỗn hợp vào xoang niệu mô phôi trứng vịt\r\n(mỗi nồng độ tiêm 5 phôi), theo dõi trứng 9 ngày sau đó mổ khám trứng chết và sống\r\nkiểm tra bệnh tích phôi.
\r\n\r\nTính toán chỉ số trung hòa NI và hiệu giá\r\ntrung hòa theo quy định tại Phụ lục B.
\r\n\r\n5.2.4.2 Phương pháp trung hòa huyết thanh\r\ntrên tế bào xơ phôi vịt
\r\n\r\nPha loãng huyết thanh cần phát hiện kháng thể\r\nthành các nồng độ 1/5, 1/10, 1/20… 1/1280. Trung hòa huyết thanh với liều 100\r\nTCID50 vi rút dịch tả vịt.
\r\n\r\nGây nhiễm hỗn hợp trên lên tế bào xơ phôi vịt,\r\ntheo dõi, kiểm tra bệnh tích tế bào trên môi trường nuôi cấy. Tính toán chỉ số\r\ntrung hòa NI và hiệu giá trung hòa theo quy định tại Phụ lục C.
\r\n\r\n\r\n\r\nVịt, ngan, ngỗng được xác định mắc bệnh dịch\r\ntả vịt khi có các đặc điểm dịch tế học, triệu chứng lâm sàng của bệnh dịch tả vịt\r\nvà kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:
\r\n\r\n- Phân lập được vi rút trên phôi trứng vịt hoặc\r\ntế bào DEF và kết quả giám định dương tính vi rút dịch tả vịt.
\r\n\r\n- Phản ứng PCR cho kết quả dương tính.
\r\n\r\n- Phản ứng realtime PCR dương tính.
\r\n\r\n- Đối với con vật chưa tiêm phòng vắc xin dịch\r\ntả vịt có kết quả dương tính khi thực hiện phản ứng trung hòa huyết thanh trên\r\nphôi trứng vịt hoặc trên tế bào DEF.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1 Dung dịch PBSx10
\r\n\r\nThành phần:
\r\n\r\nNaCl 80,0\r\ng
\r\n\r\nKCl 2,0\r\ng
\r\n\r\nNa2HPO4 11,5\r\ng
\r\n\r\nKH2PO4 2,0\r\ng
\r\n\r\nPha loãng với 1000 ml nước, điều chỉnh pH\r\n7,2. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4 oC.
\r\n\r\nA.2 Dung dịch NaHCO3 7 %
\r\n\r\nThành phần:
\r\n\r\nNaHCO3 7,0\r\ng
\r\n\r\nNước 100\r\nml
\r\n\r\nHấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4 oC.
\r\n\r\nA.3 Dung dịch L-glutamine 3 %
\r\n\r\nThành phần:
\r\n\r\nL-glutamin 3\r\ng
\r\n\r\nNước 100\r\nml
\r\n\r\nDung dịch đã pha được lọc vô trùng. Bảo quản ở\r\n-20oC.
\r\n\r\nA.4 Canh thang TPB (tryptose phosphate broth)
\r\n\r\nThành phần:
\r\n\r\nTryptoza phosphat 29,5\r\ng
\r\n\r\nNước 1000\r\nml
\r\n\r\nHấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4 oC.
\r\n\r\nA.5 Trypsin 2,5 % (10x)
\r\n\r\nThành phần:
\r\n\r\nTrypsin 2,5\r\ng
\r\n\r\nPBS 100\r\nml
\r\n\r\nLắc qua đêm ở 4oC, lọc vô trùng và bảo quản ở\r\n-20 oC.
\r\n\r\nA.6 Môi trường nuôi cấy tế bào MEM
\r\n\r\nThành phần:
\r\n\r\nMôi trường MEM (Eagle’s minimum 430\r\nml
\r\n\r\nessential medium)
\r\n\r\nTryptoza phosphat broth (TPB) 50\r\nml
\r\n\r\nL-glutamin 3 % 5\r\nml
\r\n\r\nNaHCO3 7 % 5\r\nml
\r\n\r\nKháng sinh (penicillin + streptomycin) 5\r\nml
\r\n\r\nFCS 5\r\nml
\r\n\r\n\r\n\r\n
B.1 Phân lập vi rút
\r\n\r\na) Tiêm bệnh phẩm vào phôi trứng vịt:
\r\n\r\n- Dùng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến\r\n12 ngày tuổi (không có kháng thể kháng dịch tả vịt), lấy từ trại vịt sạch bệnh.
\r\n\r\n- Soi trứng, chọn phôi khoẻ. Mỗi mẫu bệnh phẩm\r\ntiêm từ 3 phôi đến 5 phôi.
\r\n\r\n- Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70 %. Dùi vị\r\ntrí tiêm ở phía trên buồng hơi.
\r\n\r\n- Dùng bơm tiêm hút dịch bệnh phẩm đã xử lý\r\nvô trùng (bằng kháng sinh hoặc qua màng lọc 0,45 µm) rồi tiêm 0,2 ml vào\r\nxoang niệu mô.
\r\n\r\n- Gắn kín lỗ tiêm bằng keo.
\r\n\r\n- Ấp tiếp ở nhiệt độ từ 37oC đến 38oC. Mỗi\r\nngày soi trứng 2 lần, loại bỏ phôi chết trước 24 h. Theo dõi 10 ngày sau\r\ntiêm.
\r\n\r\n- Các trứng có phôi chết hoặc gần chết\r\nđược bảo quản ở nhiệt độ 4 oC. Phôi nhiễm vi rút dịch tả vịt cường độc thường\r\nchết từ 3 ngày đến 8 ngày sau khi tiêm.
\r\n\r\n- Sau 10 ngày, các trứng không chết được giữ ở\r\n4 oC để giết phôi.
\r\n\r\nb) Thu hoạch nước trứng
\r\n\r\n- Mổ trứng trong điều kiện vô trùng. Sát\r\ntrùng vỏ trứng bằng cồn 70 %.
\r\n\r\n- Dùng kéo cắt quanh buồng hơi, bộc lộ xoang\r\nniệu mô.
\r\n\r\n- Hút nước trứng vào ống Eppendorf vô trùng,\r\nbảo quản ở nhiệt độ 4 oC để kiểm tra.
\r\n\r\nB.2 Giám định vi rút
\r\n\r\nDùng phương pháp trung hòa vi rút trên phôi\r\ntrứng vịt.
\r\n\r\n- Pha loãng dịch niệu mô thu hoạch ở trên\r\nthành các nồng độ 10-1 đến 10-9 với dung dịch PBS.
\r\n\r\n- Lô đối chứng dương: trộn huyết thanh chuẩn\r\nkháng dịch tả vịt với dịch niệu mô đã pha loãng thành các nồng độ trên theo tỷ\r\nlệ 1:1.
\r\n\r\n- Lô đối chứng âm: trộn huyết thanh âm tính với\r\ndịch niệu mô đã pha loãng thành các nồng độ trên theo tỷ lệ 1:1.
\r\n\r\n- Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 1 h.
\r\n\r\n- Tiêm hỗn hợp vào xoang niệu mô phôi trứng vịt\r\ntừ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi, liều 0,2 ml/phôi; mỗi nồng độ tiêm 5 trứng.
\r\n\r\n- Ấp trứng trong tủ ấm 37oC theo dõi trong 10\r\nngày. Loại bỏ trứng chết trong vòng 24 h. Ghi chép số phôi chết.
\r\n\r\n- Nếu có vi rút dịch tả vịt lô đối chứng\r\ndương phôi sẽ sống, lô đối chứng âm phôi sẽ chết trong khoảng 3 ngày đến 8\r\nngày với bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.
\r\n\r\n- Dựa vào tỷ lệ sống chết của phôi để tính\r\ntoán liều ELD50 (hoặc EID50) và chỉ số trung hòa NI theo công thức Reed\r\n& Muench để đánh giá kết quả.
\r\n\r\n- Chỉ số trung hòa NI là chênh lệch giữa\r\nELD50 (hoặc EID50) của lô đối chứng dương tính và lô đối chứng âm tính.
\r\n\r\n- Kết quả dương tính khi NI ≥ 2.
\r\n\r\nVÍ DỤ: Thí nghiệm có kết quả chuẩn độ liều\r\nELD50 của vi rút dịch tả vịt như sau:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Công thức Reed & Muench:
\r\n\r\n![](\"00901070_files/image001.jpg\")
Như vậy, liều gây chết 50% phôi trứng là\r\n10 -7,7.
\r\n\r\nTính chỉ số trung hòa:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |||||||
| \r\n Đối chứng dương tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Đối chứng âm tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Kết quả: NI = 6,5 - 2,5 = 4,0
\r\n\r\nKết luận: bệnh phẩm dương tính vi rút dịch tả\r\nvịt.
\r\n\r\n\r\n\r\n
C.1 Chuẩn bị tế bào xơ phôi vịt (DEF - Duck\r\nEmbryo Fibroblast)
\r\n\r\n- Chọn trứng vịt có phôi từ 9 ngày tuổi đến\r\n10 ngày tuổi, phát triển tốt. Mổ trứng, lấy phôi. - Rửa phôi trong dung dịch\r\nPBS có chứa 1 % kháng sinh.
\r\n\r\n- Cắt bỏ đầu, chân, cánh và các cơ quan phủ tạng.
\r\n\r\n- Rửa lại phôi từ 1 lần đến 2 lần trong dung\r\ndịch PBS có chứa 1 % kháng sinh. - Cắt nhỏ phôi.
\r\n\r\n- Tách tế bào bằng dung dịch trypsin ấm 0,25\r\n% và lắc nhẹ 250 r/min trong 15 min.
\r\n\r\n- Thu hoạch tế bào đă tách bằng cách lọc qua\r\n4 lần vải gạc, cho vào môi trường MEM.
\r\n\r\n- Ly tâm huyễn dịch tế bào với gia tốc\r\n1500 g, trong 5 min ở 4 oC, loại bỏ phần nước trong. - Rửa lại 1\r\nlần với môi trường nuôi cấy.
\r\n\r\n- Đếm và pha loãng tế bào với môi trường phát\r\ntriển (MEM + 10 % FCS), lượng tế bào cần thiết tối thiểu 4 x 105 tế bào/ml.
\r\n\r\nC.2 Phân lập vi rút dịch tả vịt trên tế bào\r\nDEF
\r\n\r\n- Cấy tế bào DEF trên các chai nuôi tế bào\r\nT25 hoặc đĩa nuôi tế bào (đĩa 6 giếng, 24 giếng), sau 2 ngày đến 3 ngày tế bào\r\nmọc thành thảm (khoảng 70 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý, lượng\r\n100 µl/giếng hoặc 500 µl/chai. Việc cấy chuyển 2 lần là cần thiết trong quá\r\ntrình phân lập.
\r\n\r\n- Quan sát CPE trong các chai nuôi cấy thời\r\ngian 7 ngày: Vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau 2 ngày đến 4 ngày.\r\nNếu CPE đạt 70 % đến 80 % hoặc sau 7 ngày không có CPE thì tiến hành thu hoạch\r\nhỗn dịch tế bào.
\r\n\r\n- Cho các chai nuôi cấy vào nhiệt độ\r\n-20 oC đến -40 oC làm đông, sau đó giải đông, lặp lại 3 lần, cuối\r\ncùng ly tâm và thu phần nước trong để giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần 2.
\r\n\r\nC.3 Giám định vi rút dịch tả vịt trên tế bào\r\nDEF
\r\n\r\na) Chuẩn bị
\r\n\r\nTế bào DEF đă nuôi cấy được 2 ngày đến 3 ngày\r\ntrên đĩa nuôi tế bào 96 giếng.
\r\n\r\nPha loãng vi rút phân lập: các nồng độ từ\r\n10-1 đến 10-9 với môi trường nuôi cấy MEM.
\r\n\r\nLô đối chứng dương tính: trộn kháng huyết\r\nthanh dương tính dịch tả vịt với các nồng độ vi rút đă pha loãng theo tỷ lệ\r\n1:1.
\r\n\r\nLô đối chứng âm tính: trộn huyết thanh âm\r\ntính với các nồng độ vi rút đă pha loãng theo tỷ lệ 1:1.
\r\n\r\nb) Tiến hành
\r\n\r\nGây nhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đă nuôi cấy tế\r\nbào DEF (đĩa 96 giếng), 100µ/giếng, 8 giếng/nồng độ. Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm\r\nCO2 ở 37 oC trong 1 h.
\r\n\r\nĐổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy\r\nMEM 100 µl/giếng.
\r\n\r\nTiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở\r\n37oC, thời gian từ 7 ngày đến 9 ngày.
\r\n\r\nHàng ngày kiểm tra CPE , thường vi rút dịch tả\r\nvịt gây hủy hoại tế bào sau 2 ngày đến 4 ngày.
\r\n\r\nc) Đánh giá kết quả
\r\n\r\nDựa vào kết quả CPE của 2 lô để tính toán liều\r\nTCID50 và chỉ số trung hòa NI theo công thức Reed & Muench để\r\nđánh giá kết quả.
\r\n\r\nChỉ số trung hòa NI là chênh lệch giữa\r\nTCID50 của lô đôi chứng dương tính và lô đối chứng âm tính. Kết quả dương\r\ntính khi NI ≥ 2.
\r\n\r\n\r\n\r\n
D.1 Chiết tách DNA của vi rút từ mẫu bệnh phẩm
\r\n\r\nChiết tách bằng kit theo quy trình của nhà sản\r\nxuất. Dưới đây là hướng dẫn của bộ kit chiết tách QIAamp DNeasy Blood &\r\nTissue Mini Kit.
\r\n\r\n- Nhỏ 20 µl protease vào ống 1,5 ml.
\r\n\r\n- Nhỏ 200 µl huyễn dịch bệnh phẩm vào ống.
\r\n\r\n- Nhỏ 200 µl dung dịch AL vào ống.
\r\n\r\n- Lắc ống trong 15 s và ly tâm ở\r\n350g trong 15 s (spin down). - Ủ ở 56 oC trong 10 min rồi ly tâm ở\r\n350g trong 15 s.
\r\n\r\n- Nhỏ 200 µl cồn 96 % đến 100 % vào ống, lắc\r\nđều trong 15 s rồi ly tâm 350g trong 15 s. - Chuyển toàn bộ dịch\r\ntrong ống vào cột lọc có ống thu.
\r\n\r\n- Ly tâm cột lọc và ống thu với tốc độ\r\n6000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống thu mới.
\r\n\r\n- Nhỏ 500 µl dung dịch AW1 vào cột lọc, ly\r\ntâm với tốc độ 6000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống\r\nthu mới.
\r\n\r\n- Nhỏ 500 µl dung dịch AW2 vào cột lọc, ly\r\ntâm với tốc độ 20000g trong 3 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc\r\nsang ống 1,5 ml không có Dnase.
\r\n\r\n- Nhỏ 200 µl dung dịch AE vào cột lọc, ủ ở\r\nnhiệt độ phòng trong 1 min.
\r\n\r\n- Ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml với tốc độ\r\n6000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch\r\ntrong ống 1,5 ml.
\r\n\r\n- Bảo quản ống ở 4 oC nếu làm PCR ngay,\r\nhoặc ở - 20 oC nếu làm PCR sau 24 h.
\r\n\r\nD.2 Kỹ thuật PCR
\r\n\r\na) Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng\r\ndẫn của nhà sản xuất bộ kit nhân gen PCR.
\r\n\r\nb) Sử dụng cặp mồi (primers) đặc hiệu phát hiện\r\ngen của vi rút dịch tả vịt.
\r\n\r\nTrình tự cặp mồi dùng để phát hiện vi rút dịch\r\ntả vịt bằng kỹ thuật PCR
\r\n\r\n| \r\n Mồi xuôi \r\n | \r\n \r\n 5'-GAA-GGC-GGG-TAT-GTA-ATG-TA-3' \r\n | \r\n
| \r\n Mồi ngược \r\n | \r\n \r\n 5'-CAA-GGC-TCT-ATT-CGG-TAA-TG-3' \r\n | \r\n
Chu trình nhân gen
\r\n\r\n| \r\n 1 vòng \r\n | \r\n \r\n 95°C, 5 min \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n 37°C, 1 min \r\n | \r\n
| \r\n 35 vòng \r\n | \r\n \r\n 95°C, 5 s \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n 55°C, 30 s \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n 72°C, 20 s \r\n | \r\n
| \r\n 1 vòng \r\n | \r\n \r\n 72°C, 7 min \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n Giữ ở 4oC đến khi chạy điện di \r\n | \r\n
c) Chạy điện di sản phẩm PCR:
\r\n\r\nPha thạch Agar 1 % bằng dung dịch đệm TAE,\r\nđun cho tan đều, khi đã nguội, đổ vào khuôn điện di (có lược) Khi thạch\r\nđã đông, để vào trong buồng điện di có đệm TAE
\r\n\r\nCác sản phẩm PCR được pha với dung dịch\r\nloading với tỷ lệ 1:10, trộn lẫn với ethidi bromua và nhỏ vào các giếng trên miếng\r\nthạch agar (10 µl/mẫu)
\r\n\r\nChạy điện di trong 1 h ở điện thế 120 V.
\r\n\r\nRửa bỏ thuốc nhuộm bằng cách ngâm trong nước\r\n45 min và đọc kết quả bằng ánh sáng UV, chụp ảnh.
\r\n\r\nd) Đọc kết quả:
\r\n\r\n- Mẫu đối chứng dương và các mẫu dương tính\r\ncó vạch với kích cỡ 446 bp -
\r\n\r\nMẫu đối chứng âm và các mẫu âm tính không có\r\nvạch.
\r\n\r\nD.3 Kỹ thuật Real-time PCR
\r\n\r\nSử dụng kỹ thuật Real-time PCR với SYBR Geen:\r\ndùng cặp mồi (primers) như trên với các nguyên liệu cho Real-time PCR, ví\r\ndụ của bộ kit QuantiFast SYBR PCR (hãng Qiagen).
\r\n\r\nLượng chất phản ứng cho 1 mẫu như sau:
\r\n\r\n2x Master mix 12,5\r\nµl
\r\n\r\nH2O 6,5\r\nµl
\r\n\r\nMồi xuôi (20 µM) 0,5\r\nµl
\r\n\r\nMồi ngược (20 µM) 0,5\r\nµl
\r\n\r\nKết quả rPCR được hiển thị qua chương trình\r\nphần mềm của máy tính:
\r\n\r\n- Mẫu dương tính có giá trị Ct, mẫu âm tính\r\nkhông có.
\r\n\r\n- Mẫu đối chứng dương có giá trị Ct như đã biết\r\nqua định lượng (± 2 Ct)
\r\n\r\n- Mẫu đối chứng âm không có giá trị Ct.
\r\n\r\nTừ khóa: Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-11:2011, Tiêu chuẩn Việt Nam số TCVN8400-11:2011, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-11:2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Tiêu chuẩn Việt Nam số TCVN8400-11:2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400 11:2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, TCVN8400-11:2011
File gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-11:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 11: bệnh dịch tả vịt do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-11:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 11: bệnh dịch tả vịt do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn |
| Số hiệu | TCVN8400-11:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |