TIÊU CHUẨN VIỆT\r\nNAM

TCVN\r\n8400-17:2011

BỆNH\r\nĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 17: BỆNH DO VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS\r\nAUREUS GÂY RA Ở GÀ

Animal disease -\r\nDiagnostic procedure - Part 17: Staphylococcus aureus infection in chicken

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể\r\nliên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn\r\nnày không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng\r\nchúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích\r\nhợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu\r\nchuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\ndo vi khuẩn Staphylococcus aureus (S. aureus) gây ra trên gà và gà\r\ntây.

2. Thuật ngữ và định\r\nnghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định\r\nnghĩa sau: Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus)

Vi khuẩn gram dương, hình tròn, đứng thành\r\nđám như chùm nho, sinh khuẩn lạc dạng S, tròn, đường kính khoảng từ 1 mm đến 3\r\nmm sau khi nuôi cấy ở 37 oC trong vòng 18 h đến 24 h.

CHÚ THÍCH: Phần lớn các chủng S.\r\naureus gây dung huyết β trên thạch máu.

3. Thuốc thử và vật\r\nliệu thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử\r\ntinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương.

Xem Phụ lục A và Phụ lục B về mô tả các dung\r\ndịch thuốc thử.

- Thạch Chapman

- Thạch Baid-Parker

- Thạch máu

- Canh thang BHI

- Môi trường đường mannitol

- Huyết tương thỏ

Chuẩn bị huyết tương thỏ: Máu thỏ khoẻ mạnh\r\nđược lấy vô trùng, có chất chống đông máu (natri xitrat 5 % hay EDTA vô trùng)\r\nsau đó ly tâm trong khoảng từ 3000 r/min đến 5000 r/min trong từ 10 min đến 15\r\nmin, lấy phần huyết tương ở phía trên.

- Thạch urê

- Canh thang pepton

- Etanol (C2H6O)

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau:

- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 oC

- Tủ sấy

- Buồng cấy

- Kính hiển vi quang học

- Tủ lạnh

- Que cấy

- Đèn cồn

- Đĩa Petri để đổ môi trường

- Panh

- Kéo

- Lamen (coverlip)

- Phiến kính (slide)

- Pipet thủy tinh các cỡ

- Lọ thủy tinh các cỡ: 100 ml, 200 ml, 500 ml\r\nvà 1000 ml

5. Cách tiến hành

5.1 Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1 Triệu chứng lâm sàng

- Con vật bị sốt, xù lông, xã cánh, què 1\r\nchân hoặc 2 chân.

- Các khớp xương ở chân bị sưng.

- Chết đột ngột trong trường hợp nhiễm trùng\r\nmáu cấp tính.

- Ở gà con: Vùng rốn bị ướt.

5.1.2 Bệnh tích

- Bệnh tích chủ yếu của bệnh là viêm cơ\r\nxương, viêm khớp, viêm bao khớp, viêm bao hoạt dịch, viêm đệm chân. Các xương\r\nthường bị là khuỷu chân và xương đùi, ít gặp hơn là hai đầu xương đùi, đầu\r\nxương ống chân, đầu xương cánh, xương sườn hay xương cột sống.

- Viêm tủy xương, tủy xương có màu vàng của\r\ncasein hay mủ, xương mỏng.

- Trong trường hợp nhiễm trùng máu: Các cơ\r\nquan nội tạng bao gồm gan, lách, thận và phổi bị hoại tử và sung huyết.

- Các vùng da quanh khớp bị viêm hoại tử.

- Ở gà con: Túi lòng đỏ bị sưng có màu khác\r\nthường.

5.1.3 Lấy mẫu bệnh phẩm

Mẫu khớp: Lấy toàn bộ khớp xương.

Dịch khớp: Cắt bộc lộ khớp xương bằng dụng cụ\r\nvô trùng. Dùng bơm, kim tiêm, pipet hoặc tăm bông vô trùng lấy dịch ở trong khớp\r\nxương.

Mủ ở đệm chân: Sát trùng bên ngoài và dùng\r\ntăm bông vô trùng để lấy mủ ở đệm chân. Túi lòng đỏ: Lấy túi lòng đỏ cho vào lọ\r\nvô trùng.

Các mẫu phủ tạng (gan, lách, thận, phổi) mỗi\r\nloại lấy từ 10 g đến 200 g và đựng trong lọ miệng rộng hoặc túi nilon riêng mỗi\r\nloại.

Bệnh phẩm phải được bảo quản trong điều kiện\r\nlạnh từ 2oC đến 8oC và gửi về phòng xét nghiệm chậm nhất 24 h sau khi lấy mẫu\r\nvà kèm theo giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích.

CHÚ THÍCH: Tăm bông sau khi lấy mẫu cần được\r\ncho vào dung dịch bảo quan (canh thang pepton). Các dụng cụ lấy mẫu như dao,\r\nkéo, panh kẹp phải được sát trùng bằng cồn 70 % trước và sau khi lấy mẫu.

5.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

5.2.1 Nuôi cấy, phân lập

Mẫu bệnh phẩm được cấy lên môi trường thạch\r\nmáu, canh thang BHI, môi trường chọn lọc như thạch Chapman hay môi trường thạch\r\nBaid-Parker.

Hình thái khuẩn lạc trên các môi trường phân\r\nlập sau 18 h đến 24 h nuôi cấy như sau:

- Trên thạch máu: S. aureus có khuẩn\r\nlạc hình tròn, trơn, kích thước khoảng từ 1 mm đến 3 mm, màu vàng đục hay trắng\r\nđục, phần lớn gây dung huyết.

- Trên thạch Chapman: Khuẩn lạc S.\r\naureus hình tròn, trơn, màu vàng hoặc trắng.

- Trên thạch Baid-Parker: Khuẩn lạc S.\r\naureus màu đen, có quầng sáng ở xung quanh.

Chọn khuẩn lạc có hình thái đặc trưng cấy vào\r\nmôi trường thạch thường hoặc thạch máu hay canh thang BHI ủ ở 37oC trong vòng từ\r\n18 h đến 24 h để tiến hành kiểm tra hình thái vi khuẩn, các đặc tính sinh hoá.

5.2.2 Giám định vi khuẩn

5.2.2.1 Kiểm tra hình thái vi khuẩn

Làm tiêu bản: Nhỏ một giọt nước sinh lý lên\r\nphiến kính sạch. Lấy khuẩn lạc trên đĩa thạch hoà đều vào giọt nước sinh lý. Nếu\r\nlàm tiêu bản từ canh trùng thì lấy 1 vòng que cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn\r\ndàn mỏng trên phiến kính.Tiêu bản được để khô, cố định trên ngọn lửa đèn cồn và\r\nnhuộm Gram (Phụ lục A).

Vi khuẩn S. aureus bắt màu tím\r\n(Gram dương), hình tròn, tập trung thành từng đám như chùm nho.

5.2.2.2 Giám định các đặc tính sinh hóa

Giám định các tính chất sinh hóa theo Bảng 1\r\nsau đây:

Bảng 1 - Một số đặc\r\ntính sinh hóa của vi khuẩn S. aureus

Phương pháp tiến hành: theo quy định trong Phụ\r\nlục B.

6. Kết luận

Gà bị bệnh do vi khuẩn S.\r\naureus khi có các đặc điểm sau:

- Gà có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích của\r\nbệnh;

- Kết quả nuôi cấy, phân lập, giám định xác định\r\nlà vi khuẩn S. aureus.

PHỤ LỤC\r\nA

(Quy\r\nđịnh)

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

A.1 Thuốc thử

A.1.1 Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể (C25H30N3Cl) 2,0 g

Etanol 95 %  20,0 ml

Amoni oxalat [(NH4)2C2O4.2H2O] 0,8 g

Nước  80,0 ml

Hoà tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan\r\namoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2 Dung dịch fuscin basic

Fuchsin basic (C20H20ClN3) 1 g

Etanol 95 %  10 ml

Phenol (C6H6O) 5 g

Nước  100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo tỉ lệ\r\n1/10 (phần thể tích) với nước.

A.1.3 Dung dịch lugol

Kali iodua (KI) 2 g

Iôt (I2) tinh thể 1 g

Nước  200 ml

Nghiền kali iodua và iôt tinh thể, cho nước\r\nvào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4 Cồn axeton

Etanol 95 %  3 phần

Axeton (C2H6O) 1 phần

A.2 Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản, để từ 1 min đến\r\n2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô. Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa\r\nnước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn-axeton, rửa nước thật nhanh và để\r\nkhô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó\r\nrửa nước rồi thấm khô hoặc sấy khô.

A.3 Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng\r\nkính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.

PHỤ LỤC\r\nB

(Quy\r\nđịnh)

GIÁM ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HÓA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS\r\nAUREUS

B.1 Phản ứng catalase

Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch\r\nđặt lên một điểm trên phiến kính sạch. Nhỏ một giọt dung dịch H2O23 %. Phản ứng\r\ndương tính khi thấy có hiện tượng sủi bọt sau vài giây. Phản ứng âm tính khi\r\nkhông có hiện tượng sủi bọt.

B.2 Phản ứng đông vón huyết tương

Phản ứng đông vón huyết tương trong ống nghiệm:\r\nLấy 0,5 ml huyết tương thỏ cho vào ống nghiệm, cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống\r\nvà để vào tủ ấm 37 oC. Phản dương tính xuất hiện sau 2 h đến 18 h, huyết\r\ntương đông vón hoàn toàn hoặc ở dạng bán cố thể.

Phản ứng đông vón huyết tương trên phiến\r\nkính: Lấy một giọt huyết tương thỏ cho lên phiến kính, hoà khuẩn lạc nghi ngờ\r\nvào giọt huyết tương. Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện các hạt ngưng kết\r\nnổi đều.

CHÚ THÍCH: Phản ứng đông huyết tương\r\ntrong ống nghiệm có độ chính xác cao hơn vì một số tụ cầu gây bệnh cho kết quả\r\nâm tính trên phiến kính, nhưng khi làm phản ứng trong ống nghiệm cho kết quả\r\ndương tính.

B.3 Lên men đường mannitol

B.3.1 Chuẩn bị môi trường

Pha canh thang pepton theo chỉ dẫn của nhà sản\r\nxuất Chuẩn bị chỉ thị màu

- Chỉ thị màu andrade:

Fuchsin axit (C20H17N3Na2O9S3) 0, 5 g

Nước  100 ml

NaOH 1 N 16 ml

Cách pha: Nghiền fuchsin, hoà vào nước cho\r\ntan hết. Cho từ từ dung dịch NaOH 1 N, vừa cho vừa lắc đến khi chuyển màu từ đỏ\r\ntươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm thì dừng (thường từ 12 ml đến 17 ml).\r\nĐể lắng 1 h đến 2 h, lọc qua giấy lọc. Hấp 120oC trong 15 min.

Cho 1 ml chỉ thị màu Andrade vào 100 ml môi\r\ntrường canh thang peptone, chia ra các ống (mỗi ống 4 ml). Hấp 120oC trong 30\r\nmin.

Chuẩn bị đường: Các loại đường pha thành dung\r\ndịch 10 % hấp 110 oC trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở\r\n100oC trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

Cho đường vào các ống môi trường: Mỗi ống (4\r\nml) cho 0,3 ml dung dịch đường 10 %.

B.3.2 Phương pháp kiểm tra và đọc kết quả

Cấy vi khuẩn đã nuôi cấy thuần khiết vào các ống\r\ncanh thang peptone có đường, để tủ ấm 37oC sau 24 h đọc kết quả.

- Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi\r\nmàu.

- Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển màu\r\nđỏ.