CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể\r\nliên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu\r\nchuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến\r\nviệc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác\r\nan toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước\r\nkhi sử dụng tiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\ntụ huyết trùng ở trâu, bò do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định\r\nnghĩa sau:
\r\n\r\nBệnh tụ huyết trùng ở trâu\r\nbò (haemorrhagic septicemia in cattle disease)
\r\n\r\nBệnh truyền nhiễm phổ biến ở trâu, bò do vi\r\nkhuẩn P. multocida gây ra, thường xảy ra ở thể nhiễm trùng máu với đặc\r\nđiểm đặc trưng là trâu, bò chết nhanh, tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ chết cao.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Bệnh phổ biến ở châu Á và châu\r\nPhi. Ở châu Á, bệnh chủ yếu do vi khuẩn Pasteurella multocida\r\nserotype B (theo phân loại của Cater và Haddleston) gây ra.
\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử\r\ntinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương\r\nđương, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\nXem Phụ lục A và Phụ lục B về mô tả các dung\r\ndịch thuốc thử.
\r\n\r\n- Thạch máu.
\r\n\r\n- Thạch Macconkey.
\r\n\r\n- Canh thang BHI.
\r\n\r\n- Thạch urê.
\r\n\r\n- Môi trường nước pepton
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 oC.
\r\n\r\n- Tủ sấy.
\r\n\r\n- Nồi hấp.
\r\n\r\n- Buồng cấy.
\r\n\r\n- Kính hiển vi quang học.
\r\n\r\n- Tủ lạnh.
\r\n\r\n- Que cấy.
\r\n\r\n- Đèn cồn.
\r\n\r\n- Đĩa Petri để đổ môi trường.
\r\n\r\n- Panh.
\r\n\r\n- Kéo.
\r\n\r\n- Lamen (coverlip).
\r\n\r\n- Phiến kính.
\r\n\r\n- Pipet thủy tinh các cỡ.
\r\n\r\n- Lọ thủy tinh các cỡ: 100 ml, 200 ml, 500 ml\r\nvà 1000 ml.
\r\n\r\n\r\n\r\n5.1 Chẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n5.1.1 Đặc điểm dịch tễ
\r\n\r\nĐộng vật cảm nhiễm: Trâu, bò mọi lứa tuổi đều\r\ncó thể nhiễm bệnh, tuy nhiên động vật non mẫn cảm với bệnh hơn động vật già.
\r\n\r\nBệnh có tính chất lây lan cục bộ địa phương,\r\ntừng vùng nhất định, những vùng lầy lội, ruộng nước, khí hậu nóng ẩm.
\r\n\r\nBệnh xuất hiện quanh năm nhưng hay gặp nhất\r\nlà vào đầu mùa mưa. Bệnh lây lan chủ yếu qua đường hô hấp.
\r\n\r\nBệnh thường phát khi có stress như: Sự thay đổi\r\nvề khí hậu đột ngột, do điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng kém hoặc do vận chuyển động\r\nvật.
\r\n\r\n5.1.2 Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nBệnh thường xảy ra ở thể quá cấp tính và thể\r\ncấp tính, con vật chết nhanh từ vài h đến hai ngày từ khi xuất hiện những\r\ntriệu chứng lâm sàng.
\r\n\r\nCon vật đờ đẫn, sốt từ 41 oC đến\r\n42 oC, khó thở, có khi ho khan. Con vật chảy nước mắt, nước dãi, nước mũi\r\nnhiều.
\r\n\r\nSưng, phù ở vùng ngực có thể lan xuống cổ và\r\nyếm.
\r\n\r\nCó triệu chứng thần kinh: hung dữ, điên cuồng\r\n...
\r\n\r\nCó con có hiện tượng bụng chướng to.
\r\n\r\nCon vật kiệt sức, suy hô hấp và chết trong\r\nvòng vài h.
\r\n\r\n5.1.3 Bệnh tích
\r\n\r\nPhúc mạc viêm thủy thũng có nước vàng.
\r\n\r\nXoang bao tim, xoang ngực và xoang bụng có dịch\r\nmàu hồng nhạt. Phổi viêm.
\r\n\r\nHạch lâm ba xuất huyết lấm tấm, tổ chức liên\r\nkết dưới da đặc biệt là ở hạch lâm ba vùng cổ và vùng đầu. Bắp thịt và niêm mạc\r\nxuất huyết màu hồng tím.
\r\n\r\nTrong các trường hợp bệnh quá cấp tính thường\r\nkhông thể hiện bệnh tích điển hình.
\r\n\r\n5.2 Lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm
\r\n\r\nBệnh phẩm:
\r\n\r\n- Máu tim, dịch xoang bao tim: Dùng bơm, kim\r\ntiêm hoặc pipet lấy máu tim, dịch bao tim.
\r\n\r\n- Phổi: Dùng dao cắt nơi có biến đổi bệnh lý\r\nvà tổ chức lành với lượng từ 10 g đến 200 g và đựng vào lọ miệng rộng hoặc\r\ntúi nilon.
\r\n\r\n- Xương ống: Lấy dao cắt hai đầu khớp, róc sạch\r\nthịt.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Các dụng cụ lấy mẫu như dao, kéo,\r\npanh kẹp phải được sát trùng bằng cồn 70 % trước và sau khi lấy mẫu. Bệnh phẩm\r\nphải lấy vô trùng ngay sau khi gia súc chết càng nhanh càng tốt.
\r\n\r\nBệnh phẩm phải được bảo quản trong điều kiện\r\nlạnh từ 2 oC đến 8 oC và gửi về phòng xét nghiệm chậm nhất 24 h\r\nsau khi lấy mẫu kèm theo giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh\r\ntích và những thông tin về dịch tễ.
\r\n\r\n5.3 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
\r\n\r\n5.3.1 Kiểm tra hình thái vi khuẩn từ bệnh phẩm
\r\n\r\n5.3.1.1 Cách làm tiêu bản
\r\n\r\nBệnh phẩm tổ chức: Cắt một miếng nhỏ phủ tạng\r\n(gan, lách, phổi) phết lên phiến kính sạch, để khô.
\r\n\r\nBệnh phẩm máu: Lấy một giọt máu nhỏ lên phiến\r\nkính sạch, sau đó dàn mỏng đều bằng phiến kính khác, để khô.
\r\n\r\n5.3.1.2 Cố định tiêu bản
\r\n\r\nTiêu bản đã để khô, nhỏ cồn metanol ngập tiêu\r\nbản, để khô.
\r\n\r\n5.3.1.3 Nhuộm tiêu bản
\r\n\r\nNhuộm Gram theo quy định tại Phụ lục A.
\r\nNhuộm Giemsa theo quy định tại Phụ lục B.
5.3.1.4 Hình thái vi khuẩn
\r\n\r\nNhuộm Gram: Vi khuẩn P. multocida bắt\r\nmàu hồng (màu của vi khuẩn gram âm), lưỡng cực (hai đầu đậm hơn), có dạng cầu\r\ntrực khuẩn, hình chấm tròn hoặc hình que. Vi khuẩn không có nha bào, lông nhưng\r\ncó giáp mô tạo thành vòng sáng xung quanh vi khuẩn.
\r\n\r\nNhuộm Giemsa: Vi khuẩn hình bầu dục, bắt màu\r\ntím, lưỡng cực.
\r\n\r\n5.3.2 Tiêm động vật thí nghiệm
\r\n\r\nĐộng vật thí nghiệm: Chuột bạch hoặc thỏ.
\r\n\r\nTiêm động vật thí nghiệm: Máu, tuỷ xương hoặc\r\nphủ tạng được nghiền nát, hoà với nước muối sinh lý 0,9 % theo tỷ lệ 1/10,\r\ntiêm cho chuột bạch (từ 0,1 ml đến 0,2 ml), thỏ (từ 1 ml đến 2 ml) vào dưới da,\r\nxoang phúc mạc hoặc tĩnh mạch.
\r\n\r\nP. multocida làm chết động vật thí nghiệm\r\ntrong vòng 24 h đến 36 h. Máu tim và phủ tạng được lấy để phết tiêu bản kiểm\r\ntra trực tiếp trên kính hiển vi và tiến hành phân lập giám định vi khuẩn.
\r\n\r\n5.3.3 Nuôi cấy, phân lập, giám định vi khuẩn
\r\n\r\n5.3.3.1 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
\r\n\r\nBệnh phẩm được cấy vào môi trường thạch máu,\r\nthạch Macconkey, canh thang BHI. Hình thái khuẩn lạc trên các môi trường phân lập\r\nsau 24 h nuôi cấy như sau:
\r\nMôi trường canh thang BHI
- Pasteurella mọc làm đục môi trường, lắc\r\ncó vẩn nhẹ (vẩn sương mù) môi trường không có cặn ở đáy. Môi trường thạch\r\nmáu
\r\n\r\n- Khuẩn lạc của P. multocida có 3 dạng:\r\nDạng nhầy (M) kích thước to nhất, trắng hơi xám khuẩn lạc nhầy, ướt. Dạng (S)\r\nkích thước nhỏ bóng, rìa nhẵn, mặt vồng. Dạng xù xì (R) thường dẹt.
\r\n\r\n- P. multocida không gây dung huyết\r\ntrên thạch máu.
\r\n\r\n- Khuẩn lạc của P. multocida có mùi\r\ntanh của nước dãi khô.
\r\n\r\nMôi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn P.\r\nmultocida không mọc trên thạch MacConkey.
\r\n\r\nCấy khuẩn lạc có hình thái đặc trưng vào môi\r\ntrường thạch thường hoặc thạch máu hay canh thang BHI ủ ở 37 oC trong vòng\r\n18 h đến 24 h để tiến hành kiểm tra hình thái vi khuẩn, đặc tính sinh hoá.
\r\n\r\n5.3.3.2 Giám định vi khuẩn
\r\n\r\n1.3.3.2.1 Giám định hình thái vi khuẩn từ môi\r\ntrường nuôi cấy
\r\n\r\nLàm tiêu bản và cố định tiêu bản: Dùng que cấy\r\nlấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính hoặc lấy một vòng\r\nque cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn dàn mỏng lên trên phiến kính, để khô và\r\ncố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.
\r\n\r\nNhuộm tiêu bản: Tiêu bản sau khi đã cố định,\r\nnhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram (Phụ lục A).
\r\n\r\nHình thái vi khuẩn: Vi khuẩn bắt màu đỏ không\r\nnhìn rõ lưỡng cực như tiêu bản nhuộm từ tổ chức hay máu, có dạng cầu trực khuẩn\r\nhoặc đa hình thái: hình bầu dục, hình chấm tròn hoặc hình que. Vi khuẩn đứng\r\nrải rác, không thành chuỗi.
\r\n\r\n1.3.3.2.2 Giám định các đặc tính sinh hóa
\r\n\r\nGiám định các tính chất sinh hóa theo bảng\r\nsau:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Dung huyết \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Glucoza \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Lactoza \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n H2S \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Catalaza \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Oxidaza \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Indol \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Ureaza \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Phương pháp tiến hành: Phụ lục C.
\r\n\r\n1.3.3.2.3 Thử độc lực trên động vật thí nghiệm
\r\n\r\nHuyễn dịch tiêm: Lấy khuẩn lạc, phân lập được\r\ntừ bệnh phẩm sau khi đã được giám định hình thái, tính chất mọc trên các\r\nmôi trường và sinh hoá cấy vào môi trường nước thịt, nuôi cấy tĩnh (không lắc) ở\r\n37 oC sau 24 h lấy 0,2 ml canh trùng tiêm cho hai chuột theo dõi trong 7\r\nngày.
\r\n\r\nĐọc kết quả:
\r\n\r\n- Nếu tất cả 2 chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết\r\ntrùng có độc lực cao.
\r\n\r\n- Nếu một nửa số chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết\r\ntrùng có độc lực yếu.
\r\n\r\n- Nếu không có chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết\r\ntrùng không có độc lực.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Vi khuẩn tụ huyết trùng phân\r\nlập được từ động vật thí nghiệm chết sau khi tiêm bệnh phẩm không cần kiểm tra\r\nlại độc lực trên động vật thí nghiệm.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrâu, bò bị bệnh tụ huyết trùng khi có các đặc\r\nđiểm sau:
\r\n\r\n- Con vật có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng\r\nvà bệnh tích của bệnh.
\r\n\r\n- Kết quả nuôi cấy, phân lập, giám định sinh\r\nhóa xác định là vi khuẩn P.multocida. Vi khuẩn có độc lực.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1 Thuốc nhuộm
\r\n\r\nA.1.1 Dung dịch tím tinh thể
\r\n\r\nTím tinh thể\r\n(C25H30N3Cl) 2,0\r\ng
\r\n\r\nEtanol 95\r\n% 20,0\r\nml
\r\n\r\nAmoni oxalat\r\n[(NH4)2C2O4.2H2O] 0,8\r\ng
\r\n\r\nNước 80,0\r\nml
\r\n\r\nHoà tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan\r\namoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho\r\ntan hết.
\r\n\r\nA.1.2 Dung dịch fuchsin basic
\r\n\r\nFuchsin basic\r\n(C20H20ClN3) 1\r\ng
\r\n\r\nEtanol 95\r\n% 10\r\nml
\r\n\r\nPhenol\r\n(C6H6O) 5\r\ng
\r\n\r\nNước 100\r\nml
\r\n\r\nKhi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo tỉ lệ\r\n1:10 (phần thể tích) với nước.
\r\n\r\nA.1.3 Dung dịch lugol
\r\n\r\nKali iodua\r\n(KI) 2\r\ng
\r\n\r\nIôt (I2) tinh thể 1\r\ng
\r\n\r\nNước 200\r\nml
\r\n\r\nNghiền kali iodua và iôt tinh thể, cho nước\r\nvào từ từ và lắc cho tan.
\r\n\r\nA.1.4. Cồn axeton
\r\n\r\nEtanol 95\r\n% 3\r\nphần
\r\n\r\nAxeton 1\r\nphần
\r\n\r\nA.2. Cách tiến hành
\r\n\r\nNhỏ dung dịch tím lên tiêu bản, để từ 1 min đến\r\n2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô. Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau\r\nđó rửa nước nhanh và để khô.
\r\n\r\nNhỏ cồn-axeton, rửa nước thật nhanh và để\r\nkhô.
\r\n\r\nNhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó\r\nrửa nước rồi thấm khô hoặc sấy khô.
\r\n\r\nA.3. Xem tiêu bản
\r\n\r\nNhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng\r\nkính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.
\r\n\r\n\r\n\r\n
B.1 Thuốc nhuộm
\r\n\r\nGiemsa dạng bột 1\r\ng
\r\n\r\nGlyxerin\r\n[C3H5(OH)3] 60\r\nml
\r\n\r\nMetanol nguyên chất 60\r\nml
\r\n\r\nLàm nóng glyxerin đến khoảng 55oC đến 60oC\r\ntrong nồi đun cách thủy. Thêm thuốc nhuộm Giemsa, trộn đều và ủ trong 2 h. Sau\r\nđó, để nguội và thêm metanol giữ trong khoảng 2 tuần trước khi sử dụng. Khi\r\nsử dụng, pha loãng theo tỷ lệ 1/10 (phần thể tích) trong dung dịch đệm phosphat\r\n0,01 M (pH 7,0) và giữ trong 30 min.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Có thể sử dụng\r\nthuốc thử Giemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nB.2 Cách tiến hành
\r\n\r\nSau khi làm xong tiêu bản máu, cố định tiêu bản\r\nbằng metanol nguyên chất trong 10 min rồi rửa bằng nước. Nhỏ dung dịch\r\nGiemsa ngập tiêu bản, để trong 20 min đến 30 min rồi rửa nhanh với nước và sấy khô.
\r\n\r\nB.3 Xem tiêu bản
\r\n\r\nNhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng\r\nkính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.
\r\n\r\n\r\n\r\n
C.1 Giám định khả năng lên men đường glucoza,\r\nlactoza, sinh H2S, sinh hơi
\r\n\r\nC.1.1 Môi trường
\r\n\r\nDùng thạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI.\r\nThạch màu đỏ và có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên\r\nmen đường glucoza, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả\r\nnăng lên men đường lactoza.
\r\n\r\nC.1.2 Tiến hành
\r\n\r\nLấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa\r\nphần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên và tiếp tục cấy trên bề\r\nmặt nghiêng, nuôi cấy ở 37oC trong điều kiện hiếu khí 24 h.
\r\n\r\nC.1.3 Đọc kết quả
\r\n\r\na) Lên men đường lactoza:
\r\n\r\n- Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng.
\r\n- Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng.
b) Lên men đường glucoza:
\r\n\r\n- Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng;
\r\n- Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng.
c) Khả năng sinh H2S:
\r\n\r\n- Dương tính: Ống nghiệm có màu đen;
\r\n\r\n- Âm tính: Ống nghiệm không có màu đen.
\r\n\r\nd) Khả năng sinh hơi:
\r\n\r\n- Dương tính: Thạch trong ống nghiệm bị nứt\r\nhay đẩy lên;
\r\n\r\n- Âm tính: Thạch trong ống nghiệm không bị nứt\r\nhay đẩy lên.
\r\n\r\nC.2 Khả năng sinh indol
\r\n\r\nC.2.1 Thuốc thử Kovac’s
\r\n\r\nParadimetyl aminobenzaldehyt 5 g
\r\n\r\nCồn amylic (C5H11OH) 75 ml
\r\n\r\nAxit clohydric đặc 25\r\nml
\r\n\r\nTrộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt\r\nvào cồn amylic cho tan hết và để trong tủ lạnh 4oC. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml\r\nHCl, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó lại tiếp tục bổ sung HCl.
\r\n\r\nBảo quản thuốc thử trong lọ màu, ở 4oC.
\r\n\r\nC.2.2. Cách tiến hành
\r\n\r\nCấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone hoặc\r\nmôi trường nước peptone có bổ sung tryptophan, nuôi cấy ở 37oC. Sau 24 h\r\nnuôi cấy, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc\r\nnhẹ. Phản ứng dương tính khi có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa\r\nthuốc thử và môi trường (sinh indol). Phản ứng âm tính khi không có vòng\r\nmàu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường.
\r\n\r\nC.3 Phân giải Urê
\r\n\r\nCó thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea\r\nagar base - Christensen) (chuẩn bị môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn\r\ncủa nhà sản xuất).
\r\n\r\nCấy vi khuẩn vào môi trường có urê, nuôi cấy ở\r\n37oC, sau 24 h đọc kết quả.
\r\n\r\n- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi\r\nmàu.
\r\n\r\n- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu\r\ntím.
\r\n\r\nC.4 Phản ứng oxidaza
\r\n\r\nPhản ứng được tiến hành trên giấy có tẩm dung\r\ndịch 1% tetra methyl P-phenyl diamine hydroclorua. Dùng que cấy lấy khuẩn\r\nlạc từ môi trường thạch chà sát lên trên mặt giấy. Phản ứng dương tính khi xuất\r\nhiện màu đen tím sau 30 s. Phản ứng âm tính khi giấy tẩm giữ nguyên màu.
\r\n\r\nC.5 Phản ứng catalaza
\r\n\r\nDùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch\r\nđặt lên một điểm trên phiến kính sạch. Nhỏ một giọt dung dịch H2O23 % lên\r\nkhuẩn lạc trên phiến kính. Phản ứng dương tính khi thấy có hiện tượng sủi bọt sau\r\nvài giây. Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt.
\r\n\r\n\r\n\r\n
File gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-14:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 14: bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-14:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 14: bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8400-14:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |