TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8400-5:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHUẨN ĐOÁN - PHẦN 5: BỆNH\r\nTIÊN MAO TRÙNG

Animal\r\ndisease - Diagnostic procedure - Part 5: trypanosomosis disease

Lời nói đầu

TCVN 8400-5:2011 được chuyển đổi từ\r\n10 TCN 821:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định tại khoản 1 Điều 69 của\r\nLuật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật và điểm a khoản 1 Điều 7 Nghị định số 127/2007/NĐ-CP\r\nngày 01/8/2007 của Chính phủ quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật\r\nTiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật;

TCVN 8400-5:2011 do Cục Thú y biên\r\nsoạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo\r\nlường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

BỆNH\r\nĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 5: BỆNH TIÊN MAO TRÙNG

Animal\r\ndisease - Diagnostic procedure - Part 5: Trypanosomosis disease

1. Phạm vi áp\r\ndụng

Quy trình này quy định quy trình\r\nchẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên động vật như trâu, bò, lợn, ngựa, đê, cừu,\r\nchó mèo…

2. Thuật ngữ và\r\nđịnh nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật\r\nngữ và định nghĩa sau:

Bệnh tiên mao trùng (trypanosomosis\r\ndisease)

Bệnh ký sinh trùng đường máu gây ra\r\nbởi giống Trypanosoma sp.

CHÚ THÍCH: Bệnh không lây trực tiếp\r\ntừ con vật ốm sang con vật lành mà do các loại ruồi trâu và mòng hút máu truyền\r\nbệnh. Các loài động vật mắc bệnh là trâu, bò, lợn, ngựa, dê, cừu, chó mèo… Ở\r\nViệt Nam, mới chỉ xác định được loài Trypanosoma evansi gây bệnh cho\r\nđộng vật như trâu, bò, lợn, ngựa.

3. Thuốc thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng\r\ncác thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng\r\ntương đương, trừ khi có quy định khác.

- Cồn 70^o

- Metanol

- Giemsa

- Natri xitrat 3,8%

4. Thiết bị,\r\ndụng cụ

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các\r\nthiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

- Bông

- Kéo

- Kim tiêm

- Kính hiển vi

- Lamen

- Máy li tâm

- Ống hematocrit

- Ống nghiệm

- Phiến kính

- Xiranh.

5. Quy trình\r\nchẩn đoán

5.1. Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1. Đặc điểm dịch tễ

Bệnh tiên mao trùng có thể gặp hầu\r\nhết các vật nuôi như trâu, ngựa, bò, lợn, cừu, dê, chó và mèo.

Bệnh thường xảy ra ở vùng núi và\r\ntrung du, bệnh thường ít xảy ra ở đồng bằng.

Bệnh thường xảy ra khi thời tiết\r\nkhắc nghiệt, thức ăn khan hiếm vào thời gian từ tháng 10 đến tháng 4 (vụ đông\r\nxuân, do vậy bệnh còn gọi là bệnh “đổ ngã vụ đông xuân”).

5.1.2. Triệu chứng lâm sàng

5.1.2.1. Thể cấp tính

Con vật mắc bệnh sốt cao từ 40^oC\r\nđến 41^oC; sốt theo chu kỳ còn gọi là sốt hồi quy; mắt sưng, đỏ tía;\r\nkhi con vật sốt cao thường thể hiện triệu chứng thần kinh: quay cuồng, đi vòng\r\ntròn, chân run rẩy… Con vật có thể chết.

Nếu con vật không chết sẽ chuyển\r\nsang thể mạn tính mang trùng.

5.1.2.2. Thể mạn tính

Sốt cách nhật: sốt từ 40^oC\r\nđến 41^oC trong 2 ngày đến 3 ngày, sau đó nghỉ từ 4 ngày đến 6 ngày;

Con vật gầy, da khô; con vật bị\r\nthiếu máu và suy nhược;

Biểu hiện thủy thũng ở những vùng\r\nthấp, da mỏng; nhiều khi mí mắt cũng bị thủy thũng;

Con vật chảy nước mắt và mắt có\r\nnhiều dử đặc như keo;

Con vật mang thai có thể bị sảy\r\nthai;

Ở thể này, con vật có thể chết hoặc\r\nkhông.

5.1.3. Bệnh tích

Xác động vật gầy gò. Niêm mạc mắt\r\ntụ máu màu đỏ tía hoặc màu vàng sẫm hay nhạt, niêm mạc miệng, âm đạo có màu\r\nvàng. Thủy thũng ở vùng thấp như hầu, ức, nách, chân, háng, những chỗ thủy\r\nthũng chứa chất nhày như keo, máu loãng có màu hồng;

Mổ khám thấy: thịt gia súc nhão, mỡ\r\nmàu vàng thẫm; tim, phổi, lách đều sưng và tụ máu; hạch lympho sưng; xoang\r\nngực, xoang bụng, bao tim tích nước màu vàng; những chỗ thủy thủng chứa chất\r\nnhầy như keo.

5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm

5.2.1. Lấy mẫu

Dùng bông tẩm cồn, sát trùng vị trí\r\nlấy mẫu.

Dùng bơm kim tiêm chích vào tĩnh\r\nmạch rìa tai, tĩnh mạch cổ, hoặc tĩnh mạch đuôi của động vật và hút máu ra.

Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy ghi rõ\r\ncác nội dung; tên chủ gia súc, địa điểm lấy mẫu, thời gian lấy mẫu, loại gia\r\nsúc, tuổi, tinh biệt; các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích.

Mẫu lấy xong, phải được giữ trong\r\nlạnh từ 2^oC đến 8^oC và gửi về phòng thí nghiệm trong 24h.

CHÚ Ý: Lấy mẫu khi con vật sốt thì\r\nkhả năng tìm thấy tiên mao trùng trong máu cao hơn so với bình thường.

5.2.2. Phát hiện tiên mao trùng

5.2.2.1. Yêu cầu chung

Phát hiện mầm bệnh (Trypanosoma\r\nevansi) trong máu của động vật đang nhiễm bệnh.

5.2.2.2. Phương pháp tiêu bản\r\nmàu dàn mỏng nhuộm Giemsa

5.2.2.2.1. Nguyên tắc

Dựa vào hình dạng của tiên mao\r\ntrùng trong máu, tính chất bắt màu và thuốc nhuộm Giemsa của tiên mao trùng,\r\ncác thành phần hữu hình của máu.

5.2.2.2.2. Lấy mẫu

Nhỏ một giọt máu chống đông (khoảng\r\n20 ml) lên phần đầu của một phiến kính\r\nsạch.

Dùng phiến kính khác đặt nghiêng\r\ngóc từ 30^o đến 45^o; đẩy nhanh về đầu kia của phiến kính, để\r\nkhô tự nhiên. Đặt tiêu bản lên khay.

5.2.2.2.3. Các bước tiến hành

Nhỏ cồn metanol để cố định tiêu\r\nbản, để khô tự nhiên.

Nhỏ thuốc nhuộm Giemsa, để trong 1\r\nh.

Lấy tiêu bản ra, rửa dưới vòi nước\r\nchảy, để khô tự nhiên.

Kiểm tra dưới kính hiển vi độ phóng\r\nđại 1000 lần.

5.2.2.2.4. Đọc kết quả

Dương tính khi tìm thấy tiên mao\r\ntrùng bắt màu xanh lơ, nguyên sinh chất bắt màu tím hoặc xanh thẫm. Tiên mao\r\ntrùng có một nhân chính và một nhân phụ, roi… Hồng cầu bắt màu hồng đều. Bạch\r\ncầu nhân bắt màu sẫm.

5.2.2.3. Phương pháp tập trung\r\nHaematocrit

5.2.2.3.1. Nguyên tắc

Dựa vào trọng lượng của tiên mao\r\ntrùng trong máu, khả năng sống của chúng khi được giữ trong điều kiện chất bảo\r\nquản và nhiệt độ thích hợp.

5.2.2.3.2. Lấy mẫu

Lấy 70 ml máu cho vào hai ống thủy tinh kích thước 75 mm x 1,5 mm.

5.2.2.3.3. Các bước tiến hành

Bịt một đầu ống thủy tinh bằng\r\nmatit.

Đặt ống thủy tinh vào máy ly tâm\r\nchuyên dụng Hematocrit với nguyên tắc đầu bịt kín theo chiều ra ngoài. Sau đó\r\nlý tâm với tốc độ 3000 r/min trong 10 min.

Lấy ống thủy tinh ra ngoài. Bẻ phần\r\ntiếp giáp giữa huyết thanh và dung dịch vàng sẫm phía dưới. Đổ dung dịch vào\r\nphiến kính.

Đặt lamen lên phía trên phiến kính,\r\nxem ở độ phóng đại từ 100 lần đến 200 lần.

CHÚ THÍCH: Phương pháp này có thể\r\nxác định khoảng 400 tiên mao trùng/ml máu; Có thể nhỏ dầu soi kính lên giữa 2\r\nphần được tách biệt trên ống Haematocrit để đảm bảo tiếp giáp giữa vật kính và dầu\r\nsoi kính.

5.2.2.3.4. Đọc kết quả

Dương tính khi thấy Tiên mao trùng\r\ntập trung và di động.

5.2.2.4. Phương pháp tiêm truyền\r\nđộng vật thí nghiệm

5.2.2.4.1. Nguyên tắc

Tiên mao trùng có khả năng sống,\r\nnhân lên trong động vật thí nghiệm mẫn cảm như chuột nhắt trắng, chuột lang,\r\nthỏ.

5.2.2.4.2. Lấy mẫu

Lấy 0,2 ml máu chống đông đối với\r\nđộng vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng.

Lấy 0,5 ml máu chống đông đối với\r\nđộng vật thí nghiệm là chuột lang, chuột cống trắng hoặc thỏ.

5.2.2.4.3. Các bước tiến hành

Đối với chuột nhắt trắng, chuột\r\nlang, chuột cống trắng: tiêm vào xoang phúc mạc; đối với thỏ: tiêm truyền tĩnh\r\nmạch rìa tai.

Sau từ 24h đến 48 h, lấy máu đuôi\r\nchuột kiểm tra tiên mao trùng (soi tươi).

Kiểm tra chuột trong vòng từ 1 tuần\r\nđến 2 tuần.

CHÚ THÍCH: Khi làm nhiều mẫu phải\r\nđánh dấu chuột bằng phương pháp cắt lông.

5.2.2.4.4. Đọc kết quả

Dương tính khi thấy tiên mao trùng\r\ndi động trong huyết tương.

5.2.2.5. Phương pháp PCR\r\n(Polymerase Chain Reaction)

5.2.2.5.1. Nguyên tắc

Phương pháp sinh học phân tử được\r\nsử dụng để phát hiện đoạn gen đặc hiệu của tiên mao trùng bằng cách khuyếch đại\r\ngiai đoạn gen đó lên nhờ bộ kit và Primer đặc hiệu.

5.2.2.5.2. Lấy mẫu

Lấy mẫu máu tĩnh mạch cổ hoặc tai\r\ngia súc cho vào ống nghiệm có chất chống đông.

5.2.2.5.3. Các bước tiến hành

Tách chiết DNA của tiên mao trùng\r\ntừ máu gia súc dùng KIT chiết tách thực hiện quy trình theo hướng dẫn của nhà\r\nsản xuất.

Chu trình nhiệt để nhân DNA bằng\r\nPCR.

Chạy điện di: Chạy điện di trên\r\nagarose gel với nồng độ 1,5% trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Nhuộm bản gel. Soi bản gel và chụp\r\nảnh.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng bộ kit phát\r\nhiện tiên mao trùng của các hãng khác nếu cho kết quả tương đương.

5.2.2.5.4. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch\r\nduy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm;

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện\r\nvạch;

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu\r\nđối chứng dương.

5.2.3. Phát hiện kháng thể tiên\r\nmao trùng

5.2.3.1. Nguyên tắc

Phát hiện kháng thể tiên mao trùng\r\nbằng phương pháp ngưng kết trực tiếp trên phiến kính. Phản ứng ngưng kết xảy ra\r\nkhi tiên mao trùng gặp kháng thể tương ứng có trong huyết thanh gia súc cần\r\nchẩn đoán thì sẽ co cụm lại.

5.2.3.2. Các bước tiến hành

Nhỏ một giọt natri xitrat 3,8 % và\r\nmột giọt kháng nguyên sống lên phiến kính sạch.

Nhỏ huyết thanh nghi ngờ lên, trộn\r\nđều, đậy lamen, để từ 5 min đến 10 min.

Kiểm tra dưới kính hiển vi độ phóng\r\nđại 100 hoặc 200 lần.

5.2.3.3. Đọc kết quả

Dương tính khi thấy tiên mao trùng\r\nchụm lại như hình hoa cúc.

CHÚ THÍCH: Các phương pháp phát\r\nhiện kháng thể (IFAT, ELISA…) do chi phí cao nên thường dùng trong điều tra huy\r\nthanh học.

6. Kết luận\r\nbệnh

Động vật được xác định mắc bệnh\r\ntiên mao trùng khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh\r\ntiên mao trùng và kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm\r\nsau:

Phương pháp Haematocrit: Tiên mao\r\ntrùng tập trung và di động.

Phương pháp tiêu bản máu dàn mỏng\r\nnhuộm Giemsa: Tiên mao trùng bắt màu xanh lơ, nguyên sinh chất bắt màu tím hoặc\r\nxanh thẫm. Tiên mao trùng có một nhân chính và một nhân phụ, roi.

Phương pháp ngưng kết trực tiếp\r\ntrên phiến kính: Tiên mao trùng chụm lại như hình hoa cúc.

Phương pháp PCR: mẫu kiểm tra có\r\nvạch giống mẫu đối chứng dương.

Thư\r\nmục tài liệu tham khảo

[1] OIE, 2009, Trypanosoma\r\nEvansi Infections (Including Surra). Aetiology Epidemiology

[2] Diagnosis Prevention and\r\nControl References

[3] OIE, 2004, SURRA, Manual of\r\nDiagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals

[4] Phan Lục, 1997, Giáo trình\r\nký sinh trùng và bệnh ký sinh trùng

[5] JICA, Quy trình chẩn đoán\r\nbệnh.