Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8710-9:2012 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và\r\nPhát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm\r\nđịnh, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\n\r\n\r\n
CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến\r\ncác vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể\r\nđưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng.\r\nNgười sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe\r\nthích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng\r\ntiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử gan\r\ntụy ở tôm.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau\r\nđây:
\r\n\r\nBệnh hoại tử gan tụy do vi khuẩn ở tôm
NHP
\r\n\r\nBệnh truyền hiễm do vi khuẩn a-subclass - proteobacterium. Vi khuẩn có kích thước tương đối nhỏ, đa\r\nhình, gram âm, chỉ gây bệnh trong nội bào. Vi khuẩn gây bệnh NHP có hai hình\r\ndạng khác nhau về hình thái: một dạng là que nhỏ đa hình và không có tiên mao,\r\ndạng còn lại là que dài xoắn có 8 tiên mao trên đỉnh của vi khuẩn và một tiên\r\nmao phụ (đôi khi là hai) ở gờ của vùng xoắn.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Vi khuẩn NHP là một giống mới trong nhóm vi khuẩn\r\nphân giải protein nhóm a
3.1. Chẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n3.1.1. Dịch tễ học
\r\n\r\nNHP lần đầu tiên được mô tả ở Texas năm 1985. Các trận dịch\r\nkhác cũng được ghi nhận ở cả bờ biển Thái Bình Dương và Đại Tây Dương, bao gồm\r\nBrazil, Costarica, Ecuador, Mexico, Panama, Peru và Venezuela. Năm 1999 và\r\n2000, bệnh hoại tử gan đã xảy ra trên tôm sú (Penaeus monodon) nuôi thâm\r\ncanh tại các tỉnh miền Trung Việt Nam.
\r\n\r\nNHP gây bệnh trên tôm Penaeus vannamei và P.\r\nstylirostris nhưng gây chết hàng loạt ở tôm P. vannamei, cũng tìm\r\nthấy NHP ở tôm P. aztecus, P. californiensis và P. setiferus.
\r\n\r\nBệnh thường xảy ra khi nhiệt độ môi trường tăng cao (từ 29
Bệnh lan truyền trực tiếp qua đường tiêu hóa từ những con\r\ntôm mang trùng, không lan truyền dọc từ tôm bố mẹ sang tôm con.
\r\n\r\n3.1.2. Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nTôm nằm một chỗ, giảm sinh trưởng, không ăn, đường tiêu hóa\r\ntrống rỗng, hệ số chuyển đổi thức ăn cao, tỷ lệ giữa trọng lượng và chiều dài\r\nnhỏ.
\r\n\r\nLớp vỏ bị mềm, tôm bị mềm, mang bị đen hoặc sẫm màu, bề mặt\r\ncơ thể bám đầy các sinh vật cơ hội. Tôm bị hôn mê, lờ đờ, gan tụy hoại tử và có\r\nmàu trắng nhợt khác biệt với màu nâu vàng bình thường, có các vệt sọc nâu đen\r\ntrên mô gan tụy, gan tụy mềm, dễ nát vụn hay hóa lỏng, trung tâm gan chứa nước,\r\nxuất hiện những đốm trắng nhợt nhạt.
\r\n\r\n3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
\r\n\r\n3.2.1. Phương pháp PCR
\r\n\r\n3.2.1.1. Nguyên tắc
\r\n\r\nPhương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase tổng\r\nhợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của mồi, bốn loại nucleotit gồm\r\nadenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (cCTP), dùng để khuếch đại\r\nđoạn DNA đích thông qua các chu trình nhiệt. Để thực hiện phản ứng khuếch đại\r\nDNA đích gồm 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch tổng hợp mạch DNA\r\nmới.
\r\n\r\n3.2.1.2. Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng\r\nnước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có\r\nRNAase, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n- Dung dịch đệm TE (Tris - EDTA)
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl)\r\naminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng axit clohydric (HCl) để chỉnh pH 7,6.
\r\n\r\n- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic), 0,5 M
\r\n\r\nHòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh pH 8,0 bằng\r\ndung dịch NaOH 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n- Dung dịch TBE 1 X
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric\r\n- EDTA 10X): Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước, thêm 40\r\nml EDTA 0,5 M và thêm nước đến 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\nKhi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc\r\n(10X) thành dung dịch 1X.
\r\n\r\n- Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần (loading dye 6X).
\r\n\r\n- Cồn 75 %.
\r\n\r\n- Cloroform.
\r\n\r\n- Bộ kít tách chiết DNA, ví dụ: NHP IQ 2000.
\r\n\r\n- Thang chuẩn DNA (DNA marker), gồm có các thang 100 bp; 200\r\nbp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp.
\r\n\r\n- Etidi bromua (EtBr).
\r\n\r\nCẢNH BÁO AN TOÀN: Etidi bromua là chất độc hại, tránh tiếp\r\nxúc và tránh hít phải hơi từ dung dịch còn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay\r\nvà mặc áo bảo hộ lao động trong suốt thời gian tiếp xúc với EtBr.
\r\n\r\n- Agarose.
\r\n\r\n3.2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán\r\nbệnh. Yêu cầu cơ bản là phòng thử nghiệm cần có các khu vực riêng biệt để thao\r\ntác tách chiết DNA, tiến hành phản ứng PCR và điện di, đọc kết quả.
\r\n\r\n- Tủ lạnh;
\r\n\r\n- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ -20
- Máy li tâm, có thể hoạt động với gia tốc 13 000 g.
\r\n\r\n- Tủ ấm, có thể hoạt động ở nhiệt độ 95
- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, có thể hoạt động ở\r\nnhiệt độ 95 °
- Máy lắc trộn vortex;
\r\n\r\n- Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg;
\r\n\r\n- Đèn cồn;
\r\n\r\n- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 µl đến 10 µl, từ 2 µl\r\nđến 20 µl, từ 10 µl đến 100 µl, từ 100 µl đến 1 000 µl;
\r\n\r\n- Giá cho ống Eppendorf có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml;
\r\n\r\n- Máy luân nhiệt (máy PCR);
\r\n\r\n- Bếp điện hoặc lò vi sóng;
\r\n\r\n- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1 000 ml;
\r\n\r\n- Bình nón bằng thủy tinh chịu nhiệt, dung tích 250 ml;
\r\n\r\n- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;
\r\n\r\n- Buồng đổ gel;
\r\n\r\n- Bàn đọc gel (UV);
\r\n\r\n- Giấy parafin.
\r\n\r\n3.2.1.4. Lấy mẫu
\r\n\r\nTôm bố mẹ: Lấy mẫu phân tôm bố mẹ.
\r\n\r\nTôm giống (> postlarvae 8, hay hậu ấu trùng lớn hơn 8\r\nngày tuổi) đến tôm trưởng thành: lấy một phần khối gan tụy của từ 5 con đến 10\r\ncon.
\r\n\r\nTôm nhỏ hơn tôm giống (nhỏ hơn postlarvae 8): lấy phần đầu\r\ncủa từ 10 con đến 15 con.
\r\n\r\nẤu trùng biến thái: lấy cả con, khoảng 50 con.
\r\n\r\nLượng mẫu lấy để tách chiết DNA khoảng 20 mg, có thể dùng\r\ntôm còn sống hoặc mẫu tôm, mẫu phân cố định trong etanol 95 % để tách chiết\r\nDNA.
\r\n\r\n3.2.1.5. Cách tiến hành
\r\n\r\n3.2.1.5.1. Tách chiết DNA
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Hiện nay có nhiều thuốc thử và bộ kít thương mại\r\ntiện lợi cho việc tách chiết DNA (QiaGen, Promega, IQ,…). Người sử dụng có thể\r\nlựa chọn bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nVí dụ về quy trình tách chiết DNA bằng dung dịch đệm\r\nDTAB-CTAB (kít IQ 2000):
\r\n\r\nCho mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml, nếu mẫu cố định trong\r\netanol 95 % cần làm khô etanol bằng cách đổ etanol và dốc ngược trên tờ giấy lọc,\r\nđể khô tự nhiên.
\r\n\r\nCho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 µl đến 200 µl\r\ndung dịch tách chiết DTAB, nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào\r\nkhoảng 400 µl đến 500 µl dung dịch tách chiết DTAB và nghiền tiếp đến khi\r\nnhuyễn.
\r\n\r\nỦ mẫu ở 75 °C trong 5 min,\r\nsau đó làm lạnh xuống nhiệt độ phòng.
\r\n\r\nTrộn đều bằng máy trộn vortex và làm lắng hỗn hợp trên, sau\r\nđó cho 700 µl cloroform, trộn đều trong 20 s và ly tâm ở 12 000 g trong\r\n5 min.
\r\n\r\nChuyển 200 µl phần trong phía trên sang ống Eppendorft 1,5\r\nml mới, thêm 100 µl dung dịch CTAB và 900 µl nước, trộn đều, sau đó ủ ở 75
Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm ở 12 000 g\r\ntrong 10 min. Gạn bỏ dịch nổi, hòa tan phần còn lại bằng 150 µl dung dịch hòa\r\ntan, ủ ở 75 °
Ly tâm ở 12 000 g trong 5 min. Chuyển dung dịch sạch\r\nsang ống Eppendorft 1,5 ml cùng 300 µl etanol 95 %.
\r\n\r\nTrộn đều, ly tâm ở 12 000 g trong 5 min, sau đó rửa\r\nviên cùng 200 µl etanol 75 %, làm lắng xuống, làm khô viên và hòa tan viên bằng\r\nnước hoặc đệm TE.
\r\n\r\nCẢNH BÁO: Tách chiết axit nucleic phụ thuộc vào việc phân\r\ngiải hay hòa tan của các mô và sự phân tách của axit nucleic từ hỗn hợp kết cấu\r\nphức tạp. Hầu như các quy trình đều sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng\r\ngây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da\r\nvà hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc\r\nquần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.
\r\n\r\n3.2.1.5.2. Tiến hành phản ứng PCR
\r\n\r\n3.2.1.5.2.1. Cặp mồi ngoài sử dụng trong phản ứng PCR
\r\n\r\nPhản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt theo\r\nphương pháp PCR, sử dụng cặp mồi Pf -1, Pr -1, xem Bảng 1.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Pf - 1 \r\n | \r\n \r\n 5’-ACG-TTG-GAG-GTT-CGT-CCT-TCA-g-3’ \r\n | \r\n
| \r\n Pr - 1 \r\n | \r\n \r\n 5-TCA CCC CCT TGC TTC TCA TTG T-3 \r\n | \r\n
Cặp mồi Pf -1/Pr -1 dùng để khuếch đại đoạn DNA của vi khuẩn\r\nNHP có kích thước 441 bp.
\r\n\r\nChuẩn bị mồi:
\r\n\r\n- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi\r\nlắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để\r\nhoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µl làm gốc.
\r\n\r\n- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µl: pha loãng mồi gốc\r\nbằng nước không có nuclease hoặc đệm TE (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).
\r\n\r\n3.2.1.5.2.2. Chuẩn bị phản ứng
\r\n\r\nTùy theo điều kiện phòng thử nghiệm, chọn lựa hỗn hợp Mix\r\nphản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nHỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong 1 ống Eppendorf dựa\r\ntrên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối\r\nchứng âm. Sau đó hút 22,5µl hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml; ghi ký\r\nhiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, chứng dương và chứng âm.
\r\n\r\n3.2.1.5.2.3. Tiến hành phản ứng PCR
\r\n\r\nThêm 2,5 µl DNA mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR\r\nchứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng PCR (thành phần gồm: Tris-HCl 10 mM, pH 8,3,\r\nKCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, deoxynucleotide 200 mM, nồng độ 0,5 µM mỗi\r\nmồi Pf -1 và Pr -1, nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích\r\n25 µl.
\r\n\r\nCó thể sử dụng thành phần thuốc thử riêng lẻ hay sử dụng hỗn\r\nhợp phản ứng thương mại sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần\r\nnhư trên, ví dụ sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega,\r\n2X có thành phần 2X green Go Taq Reaction Buffer (pH 8,5); dATP 400 µM; dGTP\r\n400 µM; dTTP 400 µM; dCTP 400 µM; MgCl2 3 mM; Taq DNA polymerase và\r\nchất đệm tải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất\r\nđệm tải mẫu (loading dye).
\r\n\r\nVí dụ về hỗn hợp phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp phản ứng Go\r\nTaq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 2.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Promega Gotag Green Master Mix, 2X \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Pr -1 mồi \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Pr -1 mồi \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n DNA mạch khuôn \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.
\r\n\r\nChu\r\ntrình nhiệt của phản ứng PCR được nêu trong Bảng 3.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bắt cặp \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giữ ổn định \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong\r\nsuốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
\r\n\r\n3.2.1.5.3. Chạy điện di
\r\n\r\n3.2.1.5.3.1. Chuẩn bị bản gel
\r\n\r\nPha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung\r\ndịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.
\r\n\r\nSau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, khi nhiệt độ giảm\r\nxuống khoảng 40 °
Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch\r\nvào khuôn.
\r\n\r\nTiến hành đổ vào bản gel, không nên đổ bản gel dày quá 0,8\r\ncm.
\r\n\r\nKhi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.
\r\n\r\nChuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X\r\nhoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào máng điện di cho tới\r\nkhi ngập bản gel.
\r\n\r\n3.2.1.5.3.2. Điện di
\r\n\r\nHút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.
\r\n\r\nKhi thực hiện điện di, chạy kèm theo DNA marker để dự đoán\r\nkích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang DNA vào một giếng trên bản gel.
\r\n\r\nĐiện di ở hiệu điện thế 100 V đến 150 V (quan sát thấy bóng\r\nkhí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan\r\nsát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng\r\nthạch agarose, dừng quá trình điện di.
\r\n\r\nCHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành\r\nđiện di nhỏ 2 µl đệm tải mẫu 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ\r\nvào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 µl nhỏ vào một giếng trên bản gel.
\r\n\r\n3.2.1.5.4. Đọc kết quả
\r\n\r\nSau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết\r\nquả với tia UV bước sóng 302 nm.
\r\n\r\nĐối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang\r\nDNA, mẫu đối chứng dương tính và mẫu đối chứng âm tính để đưa ra kết luận.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Thang DNA \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu đối chứng dương tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu đối chứng âm tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích\r\nthước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 441bp. Thang DNA\r\nphân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm thanh không có vạch sáng.
\r\n\r\nKết quả mẫu thử âm tính khi: Không có vạch sáng kích thước\r\n441bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, thang DNA phân vạch rõ\r\nràng.
\r\n\r\n3.2.2. Phương pháp mô học
\r\n\r\n3.2.2.1. Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\n- Dung dịch Davidson (xem A.1).
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).
\r\n\r\n- Xylen.
\r\n\r\n- Cloroform.
\r\n\r\n- Axit picric (dung dịch bão hòa).
\r\n\r\n- Etanol 70 %, 90 % và etanol tuyệt đối.
\r\n\r\n- Parafin.
\r\n\r\n- Keo dán, ví dụ Bom Canada.
\r\n\r\n- Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4);
\r\n\r\n- Natri Hydro phosphat (NaH2PO4);
\r\n\r\n3.2.2.2. Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán\r\nbệnh và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Kính giải phẫu
\r\n\r\n- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu\r\nkéo các loại, lam kính và lamen
\r\n\r\n- Lọ nhỏ cố định mẫu
\r\n\r\n- Bình rót parafin
\r\n\r\n- Bộ phận làm lạnh mẫu
\r\n\r\n- Máy cắt mẫu microtome
\r\n\r\n- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ
\r\n\r\n- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu
\r\n\r\n- Kính hiển vi quang học
\r\n\r\n- Cassete
\r\n\r\n- Khung đúc mẫu.
\r\n\r\n3.2.2.3. Lấy mẫu
\r\n\r\nThu những mẫu tôm có dấu hiệu không bình thường, cơ thể yếu,\r\nbơi lội lờ đờ, biếng ăn và ruột rỗng, giảm sức tăng trưởng rõ rệt, tỷ lệ trọng\r\nlượng, chiều dài thân thấp (mỏng đuôi).
\r\n\r\nTôm có vỏ mềm và cơ thể nhũn; mang đen hoặc sẫm màu; bị\r\nnhiều vi sinh vật cơ hội bám trên mặt vỏ; vỏ bị nhiễm vi khuẩn, bao gồm các tổn\r\nthương loét lớp cutin hoặc phần phụ bị ăn mòn hóa đen; bị phồng rộp các tế bào\r\nsắc tố dẫn đến sự xuất hiện các rìa sẫm màu ở các náng đuôi và chân bụng. Khối\r\ngan tụy có thể bị teo.
\r\n\r\nKhông dùng tôm chết hoặc tôm bảo quản đá để cắt mô.
\r\n\r\n3.2.2.4. Cách tiến hành
\r\n\r\n3.2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu
\r\n\r\nCố định trong dung dịch Dadvison. Đối với ấu trùng hoặc tôm\r\nPostlarvae có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h. Số\r\ntôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong etanol 70 % ở nhiệt\r\nđộ phòng.
\r\n\r\nĐối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt giữa phần\r\nđầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó có chứa gan tụy), dùng thuốc\r\nDavidson tiêm vào gan tụy và vùng xung quanh gan tụy. Lượng thuốc dùng từ 0,1\r\nml đến 10 ml (thay đổi tùy kích thước tôm), sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch\r\nDavidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ,\r\nchiều dài mẫu không quá 3 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm\r\ntrong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay\r\ntrong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n3.2.2.4.2. Khử mẫu cố định
\r\n\r\nNgâm trong etanol 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến\r\n60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong etanol tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min\r\nđến 60 min mỗi lần.
\r\n\r\n3.2.2.4.3. Làm trong mẫu
\r\n\r\nNgâm sang lọ xylen 1, để trong 30 min đến 60 min.
\r\n\r\nNgâm sang lọ xylen 2, để trong 30 min đến 60 min.
\r\n\r\nSau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56
Đúc khuôn: đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập\r\ntrung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn\r\nlạnh hoặc để trong tủ lạnh.
\r\n\r\n3.2.2.4.4. Cắt mẫu
\r\n\r\nCắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để\r\ntrên mặt khay đá.
\r\n\r\nĐặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt\r\nchiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.
\r\n\r\nChọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước\r\n30 °
3.2.2.4.5. Nhuộm tiêu bản H&E
\r\n\r\nTẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3\r\nmin đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong etanol tuyệt đối, etanol 90 % và\r\netanol 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ\r\n3 min đến 5 min.
\r\n\r\nNgâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau\r\nđó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm\r\neosin từ 1 min đến 2 min.
\r\n\r\nLàm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ etanol 75 %,\r\netanol 90 % và etanol tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min chuyển sang xylen\r\nhai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada.\r\nĐể khô và soi kính.
\r\n\r\n3.2.2.4.6. Đọc kết quả
\r\n\r\nSoi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật\r\nkính có độ phóng đại cao (100 X, 400 X, 1 000 X).
\r\n\r\nMô học gan tụy của tôm bị bệnh hoại tử gan tụy thể hiện đặc\r\nđiểm bệnh lý sau: Các vùng mô gan tụy bị hoại tử, bắt màu đồng đều của thuốc\r\nnhuộm, hoàn toàn không còn nhìn thấy cấu trúc tế bào và mô gan tụy đồng thời\r\nxuất hiện dày đặc những tế bào máu bao vây xung quanh những vùng bị hoại tử.\r\nTrên lát cắt mô học gan tụy với thuốc nhuộm haematoxylin và eosin cho thấy dấu\r\nhiệu của sự viêm teo từ trung bình tới rất nặng của ống gan tụy. Các tế bào\r\nbiểu mô gan tụy khi bị viêm teo hoại tử chuyển từ hình trụ tròn sang hình khối,\r\nhoặc có thể bị phình to và chứa một số lớn vi khuẩn tự do giống với rickettsia,\r\ngram âm nằm trong nguyên sinh chất của các tế bào.
\r\n\r\nỞ tôm P, vannamei giai đoạn ấu niên bị nhiễm bệnh NHP\r\nnặng, mãn tính biểu mô tuyến gan tụy bị teo rõ rệt, dẫn đến phù thũng nặng\r\n(dịch tràn hoặc các khu vực có nước trong gan tụy).
\r\n\r\nĐộ phóng đại 10000X tôm bị bệnh trong tế bào chất có nhiều\r\nvi khuẩn bệnh NHP dạng hình que và hình xoắn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTôm được xác định nhiễm bệnh NHP khi có đặc điểm dịch tễ,\r\ntriệu chứng lâm sàng của bệnh và dương tính một trong hai phương pháp sau:
\r\n\r\n- Kết quả phản ứng PCR dương tính;
\r\n\r\n- Mẫu cắt mô có bệnh tích của NHP.
\r\n\r\nA.1. Dung dịch Davidson
\r\n\r\nEtanol 95 %: 330\r\nml
\r\n\r\nFormalin (formaldehyd 37 %): 220\r\nml
\r\n\r\nAxit axetic đậm đặc: 115\r\nml
\r\n\r\nNước: 335\r\nml
\r\n\r\nA.2. Thuốc nhuộm hematoxylin
Hematoxylin dạng tinh thể: 1\r\ng
\r\n\r\nNatri iodat: 0,2\r\ng
\r\n\r\nAmoni alum [NH4Al(SO4)2]\r\nhoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g
\r\n\r\nAxit xitric: 1\r\ng
\r\n\r\nCloral hydrat: 50\r\ng
\r\n\r\nNước: 1\r\n000 mg
\r\n\r\nHòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và\r\namomi alum hoặc kali alum, hòa tan, tiếp tục cho axit xitric và cloral hydrat\r\nrồi lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\nA.3. Thuốc nhuộm eosin
\r\n\r\nEosin Y: 1 g
\r\n\r\nEtanol 70 %: 1 lít
\r\n\r\nAxit axetic băng: 5 ml
\r\n\r\nThêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hòa\r\ntan eosin trong etanol, sau đó cho thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\n[1] Bacterial disease of shrimp C.10 Neccrotising Hepatopancreatitis\r\n(NHP). Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases.207 – 10
\r\n\r\n[2] Boris Brinez, Fernando Aranguren, Marcela Salazar (2003)\r\nFecal samples as a DNA source for the diagnosis of necrotizing\r\nhepatopancreatitis (NHP) in Penaeus vannamei broodstock. Dis Aquat\r\nOrg Vol. 55: 69 – 72
\r\n\r\n[3] Diseases of crustaceans, Bacterial diseases –\r\nNecrotising hepatopancreatitis. Sourced form AGDAFF-NACA (2007). Aquatic\r\nAnimal Diseases Significant to Asia-Pacific
\r\n\r\n[4] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị\r\nMuội. Bệnh học thủy sản. 2004. 232-235.
\r\n\r\n[5] Loy JK, Frelier P, Varner P, Templeton JW (1996)\r\nDetection of the etiologic agent of necrotizing hepatopancreatitis in cultured Penaeus\r\nvannamei from Texas and Peru by polymerase chain reaction. Dis Aquat Org\r\nVol 25:117 – 122
\r\n\r\n[6] Frelier PF, Sis RF, Bell TA, Lewis DH(1992) Microscopic\r\nand ultrastructural features of necrotizing hepatopancreatitis in Texas cultured shrimp (penaeus vannamei). Vet Pathol 29: 269 - 277
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-9:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8710-9:2012 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2012-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |