Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8710-6:2012 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và\r\nPhát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm\r\nđịnh. Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\n\r\n\r\n
CẢNH BÁO: Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến\r\ncác vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể\r\nđưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng.\r\nNgười sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe\r\nthích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng\r\ntiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh do KHV (Koi\r\nherpesvirus) ở cá chép.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau\r\nđây:
\r\n\r\nBệnh do KHV ở cá chép (Koi herpesvirus disease)
\r\n\r\nBệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây ra bởi vi rút Koi\r\nherpesvirus thuộc họ Herpesviridae.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 1: Vi rút dạng hình cầu hai mươi mặt, có axit\r\nnucleic là DNA mạch đôi, kích thước khoảng 277 kbp.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 2: Hiện nay đã có ba chủng vi rút được nghiên cứu\r\nvà mô tả: KHV phân lập từ Israel, Mỹ và Nhật Bản. Kết quả giải mã di truyền gen\r\ncủa ba chủng vi rút này cho thấy sự tương đồng về kiểu gen là rất cao. Tuy\r\nnhiên, bộ gen của vi rút phân lập từ Israel và Mỹ có độ tương đồng cao hơn so\r\nvới bộ gen phân lập từ Mỹ so với Nhật Bản, Israel và Nhật Bản.
\r\n\r\n\r\n\r\n3.1. Chuẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n3.1.1. Dịch tễ học
\r\n\r\nĐặc điểm phân bố: Bệnh do KHV trở thành bệnh dịch động vật\r\nthủy sản ở các loài các thuộc họ Cá chép: Cyprinus carpio carpio, Cyprinus\r\ncarpio koi, Cyprinus carpio goi và các dòng cá chép lai.
\r\n\r\nGiai đoạn cảm nhiễm: cá giống từ 2,5 g đến 6 g dễ cảm nhiễm\r\nhơn cá lớn hơn 230 g.
\r\n\r\nTỷ lệ cảm nhiễm và tỷ lệ chết liên quan đến nhiệt độ nước:\r\ntỷ lệ chết có thể lên đến 100 % ở nhiệt độ khoảng 18
Con đường xâm nhập của vi rút: vi rút có khả năng tồn tại\r\ntrong môi trường nước ít nhất 4 h, vi rút xâm nhập qua da và mang, gây tổn\r\nthương da, mang sau đó xâm nhập đến các cơ quan nội tạng: thận, gan, lách, mô\r\nruột. Thể vi rút tấn công vào nhân, tế bào chất của tế bào vật chủ. Vì vậy,\r\nbệnh lây lan từ cá bệnh sang cá khỏe, từ dòng nước nhiễm vi rút, từ vật chủ\r\ntrung gian, các loài chim ăn cá có mang KHV vào vùng nuôi.
\r\n\r\n3.1.2. Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nTrạng thái: dấu hiệu đầu tiên cá ngạt thở, giảm ăn, bơi gần\r\ntầng mặt, mang và da cá có màu sắc nhợt nhạt, mang bị hoại tử, xuất huyết tơ\r\nmang, mắt lõm xuống, da mất nhớt, có thể bị hoại tử.
\r\n\r\nCá bị bệnh do KHV rất dễ bị nhiễm các tác nhân thứ cấp khác,\r\nkhi lấy nhớt mang kiểm tra dưới kính hiển vi thường gặp số lượng lớn vi khuẩn,\r\nnấm và kí sinh trùng ngoại kí sinh khác nhau: Argulus sp, Chilodonella\r\nsp, Cryptobia sp, Dactylogyrus sp, Gyrodactylus sp…
\r\n\r\nDấu hiệu bên trong của bệnh do KHV: gan, thận có trường hợp\r\nsưng to hơn bình thường, có thể bị xuất huyết.
\r\n\r\nTrong trường hợp cấp tính: cá chết rất nhanh mà không thể\r\nhiện dấu hiệu tổn thương cơ quan nội tạng.
\r\n\r\nCơ quan đích: mang, gan, thận, lách và ruột, máu.
\r\n\r\n3.2. Chuẩn đoán trong phòng thí nghiệm (Phương pháp PCR)
\r\n\r\n3.2.1. Nguyên tắc
\r\n\r\nPhương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase tổng\r\nhợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của mồi, bốn loại nucleotit gồm\r\nadenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại\r\nđoạn DNA đích thông qua các chu trình nhiệt. Việc thực hiện phản ứng khuếch đại\r\nDNA đích gồm 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch tổng hợp mạch DNA\r\nmới.
\r\n\r\n3.2.2. Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng\r\nnước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có\r\nRNAase, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n- Dung dịch đệm TE (Tris - EDTA)
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl)\r\naminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng axit clohydric (HCl) để chỉnh pH 7,6.
\r\n\r\n- Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA\r\n10 X)
\r\n\r\nHòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước.\r\nThêm 40 ml EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\nKhi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc\r\n(10X) thành dung dịch TBE 1X.
\r\n\r\n- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M
\r\n\r\nHòa tan 93,05 g EDTA trong 350 mL nước, chỉnh pH 8,0 bằng\r\ndung dịch NaOH nồng độ 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n- Dung dịch DEPC
\r\n\r\nDung dịch dietypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn đều\r\nkhoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng\r\nở 121 °
- Bộ kít tách chiết DNA.
\r\n\r\n- Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần (loading dye 6X)
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch gồm Tris – HCl 10 mM (pH 7,6); xanh\r\nbromophenol 0,03 %; xylem xyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM (sử\r\ndụng dung dịch EDTA 0,5 M). Bảo quản ở nhiệt độ -20
- Etanol 95° (95 % thể\r\ntích).
\r\n\r\n- Thang chuẩn DNA (DNA marker) gồm có các thang 100 bp; 200,\r\nbp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp.
\r\n\r\n- Etidi bromua (EtBr).
\r\n\r\nCẢNH BÁO AN TOÀN: Etidi bromua là chất độc hại, tránh tiếp\r\nxúc và tránh hít phải hơi từ dung dịch còn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay\r\nvà mặc áo bảo hộ lao động trong suốt thời gian tiếp xúc với EtBr.
\r\n\r\n- Agarose.
\r\n\r\n3.2.3. Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán\r\nbệnh. Yêu cầu cơ bản là phòng thử nghiệm cần có các khu vực riêng biệt để thao\r\ntác chiết DNA, tiến hành phản ứng PCR và điện di đọc kết quả.
\r\n\r\n- Tủ lạnh;
\r\n\r\n- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ -20
- Máy li tâm, có thể hoạt động với gia tốc 13 000 g;
\r\n\r\n- Tủ ấm, có thể hoạt động ở nhiệt độ 95
- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, có thể hoạt động ở\r\nnhiệt độ 95 °
- Máy lắc trộn vortex;
\r\n\r\n- Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg;
\r\n\r\n- Đèn cồn;
\r\n\r\n- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 µl đến 10 µl, từ 2 µl\r\nđến 20 µl, từ 10 µl đến 100 µl, từ 100 µl đến 1000 µl;
\r\n\r\n- Máy luân nhiệt (máy PCR);
\r\n\r\n- Bếp điện hoặc lò vi sóng;
\r\n\r\n- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml;
\r\n\r\n- Bình nón bằng thủy tinh chịu nhiệt, dung tích 250 ml;
\r\n\r\n- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;
\r\n\r\n- Buồng độ gel;
\r\n\r\n- Bàn đọc gel (UV);
\r\n\r\n- Giấy parafin.
\r\n\r\n3.2.4. Lấy mẫu
\r\n\r\nThu khoảng 10 con cá có dấu hiệu bệnh.
\r\n\r\nCá có kích thước nhỏ hơn 4 cm: dùng kéo cắt bỏ phần thịt\r\nthân cá tới phía sau hậu môn, lấy phần nội tạng sau đó cho vào ống Eppendorf\r\n1,5 ml sạch.
\r\n\r\nCác có kích thước từ 4 cm đến 6 cm: lấy toàn bộ thận, gan,\r\nlách chứa trong ống nhựa (có thể dùng ống Eppendorf 1,5 ml).
\r\n\r\nMẫu được bảo quản trong thùng chứa có thành dày, xếp đá sao\r\ncho nhiệt độ luôn đảm bảo khoảng 4 °C,\r\ntrong 24 h phải xử lý ngay. Khi bảo quản ở -80 °C, mẫu có thể giữ được tới vài năm.
\r\n\r\nCó thể cố định mẫu trong etanol 95
3.2.5. Cách tiến hành
\r\n\r\n3.2.5.1. Tách chiết DNA
\r\n\r\nChú thích: Hiện nay có rất nhiều thuốc thử và bộ kít thương\r\nmại tiện lợi cho việc tách chiết DNA (QiaGen, Promega…). Người sử dụng có thể\r\nlựa chọn bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nVí dụ quy trình tách chiết DNA bằng Lysis Buffer (kit\r\nIQ2000KHV):
\r\n\r\nCho mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml.
\r\n\r\nNếu mẫu cố định trong etanol 95
Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 µl đến 200 µl\r\ndung dịch tách chiết, nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào\r\nkhoảng 300 µl đến 400 µl dung dịch tách chiết và nghiền tiếp đến khi nhuyễn.
\r\n\r\nỦ mẫu ở nhiệt độ 95 °C\r\ntrong 10 min, ly tâm 12000 g trong thời gian 10 min.
\r\n\r\nChuyển 200 µl phần dịch nổi sang ống Eppendorf mới có chứa\r\n400 µl etanol 95°
Ly tâm 12000 g trong thời gian 5 min, sau đó loại bỏ\r\netanol và làm khô mẫu.
\r\n\r\nHòa tan DNA bằng nước tinh khiết hoặc dung dịch đệm TE 1X\r\nvới lượng khoảng từ 50 µl đến 200 µl tùy thuộc vào lượng DNA tách chiết được.
\r\n\r\nCảnh báo: Tách chiết axit nucleic phụ thuộc vào việc phân\r\ngiải hay hòa tan của các mô và sự phân tách của axit nucleic từ hỗn hợp kết cấu\r\nphức tạp. Hầu như các quy trình đều sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng\r\ngây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da\r\nvà hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc\r\nquần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.
\r\n\r\n3.2.5.2. Tiến hành phản ứng PCR
\r\n\r\n3.2.5.2.1. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
\r\n\r\nVí dụ về phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân\r\nnhiệt theo phương pháp PCR khuếch đại DNA đặc hiệu của KHV, sử dụng cặp mồi của\r\nBercovier TK:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi xuôi \r\n | \r\n \r\n 5’-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3’ \r\n | \r\n
| \r\n Mồi ngược \r\n | \r\n \r\n 5’-CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC-3’ \r\n | \r\n
Cặp mồi trên dùng để khuếch đại đoạn DNA của KHV có kích\r\nthước 409 bp.
\r\n\r\nChuẩn bị mồi:
\r\n\r\n- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi\r\nlắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để\r\nhoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µl làm gốc.
\r\n\r\n- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µl: pha loãng mồi gốc\r\nbằng nước không có nuclease (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).
\r\n\r\n3.2.5.2.2. Chuẩn bị phản ứng
\r\n\r\nTùy theo điều kiện phòng thử nghiệm, chọn lựa hỗn hợp Mix\r\nphản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nHỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong 1 ống Eppendorf dựa\r\ntrên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu\r\nđối chứng âm. Sau đó hút 22,5 µl hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml; ghi\r\nký hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.
\r\n\r\n3.2.5.2.3. Tiến hành phản ứng PCR vòng ngoài (bước 1)
\r\n\r\nThêm 2,5 µl DNA mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR\r\nchứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng PCR (thành phần gồm: KCl 50 mM; Tris-HCl 10\r\nmM, pH 9; Triton X-100 0,1 %; mỗi dNTP nồng độ 0,2 mM; MgCl2 1,5 mM;\r\nmỗi mồi xuôi và mồi ngược có nồng độ 1 µM; 1,25 U of Taq DNA polymerase và nước\r\ncho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.
\r\n\r\nCó thể sử dụng thành phần thuốc thử riêng lẻ hay sử dụng hỗn\r\nhợp phản ứng thương mại sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng các thành phần như\r\ntrên, ví dụ sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega 2X có\r\nthành phần 2X green Go Taq Reaction Buffer (pH 8,5); dATP 400 µM; dGTP 400 µM;\r\ndTTP 400 µM; dCTP 400 µM; MgCl2 3 mM; Taq DNA polymerase và chất đệm\r\ntải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất đệm tải\r\nmẫu (loading dye).
\r\n\r\nVí dụ về hỗn hợp phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp phản ứng Go\r\nTaq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 2.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Promega Gotag Green Master Mix, 2X \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi xuôi \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi ngược \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n DNA mạch khuôn \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.
\r\n\r\nChu\r\ntrình nhiệt của phản ứng PCR được nêu trong Bảng 3.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bắt cặp \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong\r\nsuốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
\r\n\r\n3.2.5.3. Chạy điện di
\r\n\r\n3.2.5.3.1. Chuẩn bị bản gel
\r\n\r\nPha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung\r\ndịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.
\r\n\r\nSau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, khi nhiệt độ giảm\r\nxuống khoảng 40 °
Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khôn, rồi đổ thạch vào\r\nkhuôn.
\r\n\r\nTiến hành đổ vào bản gel, không nên đổ bản gel dày quá 0,8\r\ncm.
\r\n\r\nKhi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.
\r\n\r\nChuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X\r\nhoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào máng điện di cho tới\r\nkhi ngập bản gel.
\r\n\r\n3.2.5.3.2. Điện di
\r\n\r\nHút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.
\r\n\r\nKhi thực hiện điện di, chạy kèm theo thang trọng lượng phân\r\ntử chuẩn để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang DNA vào một\r\ngiếng trên bản gel.
\r\n\r\nĐiện di ở hiệu điện thế 100 V đến 150 V, trong thời gian 35 min\r\nđến 40 min.
\r\n\r\nCHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành\r\nđiện di nhỏ 2 µl đệm tải mẫu 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra,\r\nnhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 µl nhỏ vào một giếng trên bản gel.
\r\n\r\n3.2.5.4. Đọc kết quả
\r\n\r\nSau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết\r\nquả với tia UV ở bước sóng 302 nm.
\r\n\r\nĐối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang\r\nDNA, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm để đưa ra kết luận.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Thang DNA \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu đối chứng dương tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu đối chứng âm tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Kết quả mẫu thử dương tính khi xuất hiện vạch sáng có kích\r\nthước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 409 bp, thang DNA\r\nphân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm không có vạch sáng.
\r\n\r\nKết quả mẫu thử âm tính khi mẫu không có vạch sáng kích\r\nthước 409 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, thang DNA phân vạch\r\nrõ ràng, mẫu đối chứng dương có vạch sáng 409 bp.
\r\n\r\n\r\n\r\nMẫu được xác định nhiễm bệnh do KHV khi có đặc điểm dịch tễ,\r\ntriệu chứng lâm sàng của bệnh và kết quả phản ứng PCR phát hiện vi rút dương\r\ntính.
\r\n\r\n[1] Bercovier H., Fishman Y., Nahary R., Sinai S., Zlotkin\r\nA., Eyngor M., Gilad O., Eldar A. & Hedrick R.P. 2005. Cloning of the koi\r\nherpesvirus (KHV) gene encoding thymidine kinase and its use for a highly\r\nsensitive PCR based diagnosis. BMC Microbiol., 5, 1-9.
\r\n\r\n[2] Bùi Quang Tề. 2008. Bệnh học thủy sản.
\r\n\r\n[3] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2010.\r\nChương 2.3.6. Koi herpesvirus disease.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 6: Bệnh do Koi Herpesvirus ở cá chép đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 6: Bệnh do Koi Herpesvirus ở cá chép
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8710-6:2012 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2012-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |