TIÊU\r\nCHUẨN QUỐC GIA

TCVN\r\n13262-4:2020

THUỐC\r\nBẢO VỆ THỰC VẬT – PHẦN 4: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT NHÓM CITOKININS BẰNG\r\nPHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Pesticides -\r\nPart 4: Determination of cytokinins group content by\r\nhigh performance liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 13262-4: 2020 do Cục Bảo vệ thực vật\r\nbiên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn\r\nĐo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THUỐC BẢO VỆ\r\nTHỰC VẬT – PHẦN 4: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT NHÓM CYTOKININS BẰNG PHƯƠNG\r\nPHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Pesticides -\r\nPart 4: Determination of cytokinins group content by\r\nhigh performance liquid chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định\r\nhàm lượng hoạt chất nhóm cytokinins (cytokinin) gồm (zeatin, zeatin riboside,\r\nkinetin và benzylaminopurine) trong thuốc bảo vệ thực vật bằng sắc ký lỏng hiệu\r\nnăng cao.

Thông tin giới thiệu hoạt chất nhóm\r\ncytokinins xem Phụ lục A.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết\r\ncho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân\r\ntích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

3  Nguyên tắc

Cytokinins tổng số được xác định bằng phương\r\npháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng cột pha đảo (C18) với detector tử ngoại\r\n(DAD, MWD, PDA,... hoặc tương đương), ở bước sóng 270 nm. Kết quả định danh\r\nđược xác định dựa trên sự so sánh giữa thời gian lưu của píc mẫu thử và píc\r\nchuẩn. Kết quả định lượng được xác định dựa trên đường chuẩn.

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân\r\ntích, nước dùng trong quá trình phân tích đạt loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696)\r\nhoặc có độ tinh khiết tương đương, sau đây gọi là nước.

4.1  Chất chuẩn zeatin, đã biết hàm\r\nlượng, được chứng nhận.

4.2  Chất chuẩn zeatin riboside, đã biết hàm\r\nlượng, được chứng nhận.

4.3  Chất chuẩn kinetin, đã biết hàm\r\nlượng, được chứng nhận.

4.4  Chất chuẩn benzylaminopurine, đã biết hàm\r\nlượng, được chứng nhận.

4.5  Acetonitrile (C₂H₃N),\r\ndùng cho sắc ký lỏng.

4.6  Metanol (CH₄O),\r\ndùng cho sắc ký lỏng.

4.7  Axit axetic băng (C₂H₄O₂),\r\ndùng cho sắc ký lỏng.

4.8  Dung dịch axetic, 0,1 % theo\r\nthể tích

Dùng pipet (5.3) lấy 1 ml axit axetic băng\r\n(4.7) cho vào cốc dung tích 1000 ml (5.1) có chứa sẵn 1000 ml nước cất. Siêu âm\r\n10 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

4.9  Kali hidroxit (KOH), tinh\r\nkhiết phân tích.

4.10  Dung dịch kali hidroxit (KOH), nồng\r\nđộ khoảng 0,05M.

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,28 gram\r\nkali hidroxit (4.9) chính xác đến 0,0001 g vào bình định mức dung tích 100 ml\r\n(5.2), hòa tan và định mức tới vạch bằng nước.

4.11  Dung dịch chuẩn gốc

4.11.1  Dung dịch chuẩn gốc zeatin, nồng độ\r\nkhoảng 1000 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g\r\nchất chuẩn cytokinin zeatin, chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 10 ml\r\n(5.2), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10) định mức đến vạch bằng\r\nmetanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

4.11.2  Dung dịch chuẩn gốc zeatin\r\nriboside,\r\nnồng độ khoảng 1000 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g\r\nchất chuẩn cytokinin zeatin riboside (4.2), chính xác đến 0,00001 g vào bình\r\nđịnh mức 10 ml (5.2), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10) định mức\r\nđến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

4.11.3  Dung dịch chuẩn gốc kinetin, nồng độ\r\nkhoảng 1000 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g\r\nchất chuẩn cytokinin kinetin (4.3), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức\r\n10 ml (5.2), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10) định mức đến vạch\r\nbằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

4.11.4  Dung dịch chuẩn gốc\r\nbenzylaminopurine, nồng độ khoảng 1000 mg/l

Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g\r\nchất chuẩn cytokinin benzylaminopurine (4.4), chính xác đến 0,00001 g vào bình\r\nđịnh mức 10 ml (5.2), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10) định mức\r\nđến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

4.12  Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung\r\ngian,\r\nnồng độ khoảng 100 mg/l

Dùng pipet (5.3) hút 2 ml các dung dịch chuẩn\r\ngốc (4.11) vào bình định mức 20 ml (5.2), hòa tan và định mức đến vạch bằng\r\nmetanol (4.6), siêu âm trong 1 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

4.13  Dãy dung dịch chuẩn làm việc, nồng độ\r\nkhoảng 1; 2; 4; 6; 8 mg/l

Dùng pipet (5.3) lấy chính xác 0,1; 0,2; 0,4;\r\n0,6; 0,8 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.12) vào lần lượt 5 bình định mức dung\r\ntích 10 ml ( 5.2), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10) định mức đến\r\nvạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 1 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

CHÚ THÍCH:

1) Chất chuẩn bảo quản trong tủ mát ở 4 °C ±\r\n2 °C;

2) Nếu sử dụng cân có cấp chính xác 0,0001 g\r\nthì lượng mẫu và chuẩn tăng lên 10 lần;

3) Dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn\r\ntrung gian nên bảo quản ở 4 °C ± 2 °C, nên sử dụng trong vòng 1 tháng kể từ\r\nngày pha;

4) Dung dịch chuẩn phải kiểm tra chất lượng\r\ntrước khi sử dụng.

5) Dung dịch chuẩn làm việc nên sử dụng ngay\r\nsau khi pha từ dung dịch chuẩn trung gian.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường\r\ncủa phòng thử nghiệm cụ thể như sau:

5.1  Cốc thủy tinh, dung tích\r\n50ml; 100ml; 1000 ml.

5.2  Bình định mức, dung tích 10\r\nml; 20 ml; 50 ml; 100 ml.

5.3  Pipet chia vạch, dung tích\r\n0,5 ml; 1 ml; 2 ml; 5 ml; 10 ml.

5.4  Xyranh bơm mẫu, dung tích 50\r\nμl, chia vạch đến 1 μl. hoặc bơm mẫu tự động

5.5  Màng lọc xyranh PTFE, có kích\r\nthước lỗ 0,45 μm, đường kính 25 mm.

5.6  Bể siêu âm, tần số siêu\r\nâm từ 40 kHz đến 100 kHz.

5.7  Cân phân tích, có độ chính\r\nxác đến 0,00001 g và 0,0001 g.

5.8  Xyranh lọc mẫu, dung tích 1\r\nml dùng cho màng lọc xyranh PTFE (5.5)

5.9  Sàng rây, đường kính\r\nlỗ 0,2 mm

5.10  Bộ lọc dung môi, màng lọc\r\nPTFE có kích thước lỗ 0,45 μm.

5.11  Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng\r\ncao,\r\nđược trang bị như sau:

- Detector tử ngoại (DAD, MWD, PDA,... hoặc\r\ntương đương);

- Hệ thống bơm cao áp;

- Buồng điều nhiệt cột tách;

- Máy tích phân hoặc máy vi tính;

- Cột RP C18, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm,\r\ncỡ hạt pha tĩnh 5 μm hoặc loại tương đương;

- Bộ bơm mẫu tự động hoặc bơm mẫu bằng tay.

6  Lấy mẫu và chuẩn\r\nbị mẫu

6.1  Lấy mẫu

Tiêu chuẩn này không qui định việc lấy mẫu.

Nên lấy mẫu theo TCVN 12017 : 2017

6.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu cần được làm đồng nhất trước khi cân: Đối\r\nvới mẫu dạng lỏng phải lắc đều, nếu bị đông đặc do nhiệt độ thấp cần được làm\r\ntan chảy ở nhiệt độ (30 ± 2) °C; đối với mẫu dạng bột phải được trộn đều; đối\r\nvới mẫu dạng hạt thì phải nghiền mịn và rây qua rây có đường kính lỗ 0,2 mm,\r\ntrộn đều làm mẫu phân tích.

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Dùng cân phân tích (5.7) cân 2 phần mẫu thử\r\nmỗi phần khoảng 1 g, chính xác đến 0,0001 g vào cốc dung tích 50 ml (5.1), thêm\r\n1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10), 10 ml metanol (4.6). Đặt vào bể siêu\r\nâm (5.6), siêu âm 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng. Chuyển toàn bộ vào bình\r\nđịnh mức 20 ml (5.2), tráng rửa 2 lần mỗi lần 3 ml methanol (4.6). Định mức đến\r\nvạch bằng metanol (4.6), lọc qua màng lọc xyranh 0,45 μm (5.5) trước khi bơm\r\nvào thiết bị.

7.2  Điều kiện phân tích

Các điều kiện vận hành sắc ký sau đây được\r\ncho là thích hợp:

Tỷ lệ pha động:

7.3  Dựng đường chuẩn

Dựng đường chuẩn (tương quan giữa diện tích\r\npíc và nồng độ chất chuẩn) của một hoạt chất tại 5 điểm có nồng độ tương ứng\r\ndãy dung dịch chuẩn làm việc (4.13).

7.4  Xác định

Dùng xyranh (5.4) bơm điểm nồng độ thấp nhất\r\ntrong dãy dung dịch chuẩn làm việc (4.13) cho đến khi số đo diện tích của pic\r\nchuẩn thay đổi không lớn hơn 3 %. Sau đó, bơm lần lượt dung dịch chuẩn làm việc\r\ntừ nồng độ thấp đến cao (4.13) và dung dịch mẫu thử (7.1), lặp lại 2 lần (số đo\r\ndiện tích của pic chuẩn thay đổi không lớn hơn 3 % so với giá trị ban đầu). Nếu\r\nnồng độ của mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn thì điều chỉnh bằng cách pha loãng\r\ndung dịch mẫu thử bằng metanol (4.6).

8  Tính kết quả

Hàm lượng hoạt chất cytokinins trong mẫu là\r\ntổng hàm lượng các loại cytokinins được quy định trong mục 1, X, biểu\r\nthị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức:

trong đó:

X_0i là nồng độ\r\ncủa cytokinin thứ i trong mẫu tính theo đường chuẩn, tính bằng miligam trên lít\r\n(mg/l);

V là thể tích dung môi\r\nchiết mẫu mililit (ml)

m là khối lượng mẫu\r\nthử, tính bằng gam (g)

P_i là độ tinh khiết của\r\nchất chuẩn cytokinin thứ i

Kết quả thử nghiệm thu được, lấy hai chữ số\r\nsau dấu phẩy.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết\r\nđầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn\r\ntiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong\r\ntiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có\r\nảnh hưởng tới kết quả;

Phụ\r\nlục A

(Tham\r\nkhảo)

Giới thiệu hoạt chất nhóm cytokinins

A.1  Giới thiệu hoạt chất cytokinin\r\nzeatin

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất: cytokinin zeatin

- Tên hóa học: IUPAC: (E)-2-methyl-4-(7H-purin-6-ylamino)but-2-en-1-ol

- Công thức phân tử: C₁₀H₁₃N₅O

- Khối lượng phân tử: 219,248 g/mol

- Nhiệt độ nóng chảy: 208 °C đến 210 °C

- Độ hòa tan: Tan tốt trong dung môi hữu cơ

- Dạng bên ngoài: Chất rắn, màu trắng đến\r\nvàng

A.2  Giới thiệu hoạt chất cytokinin\r\nzeatin riboside

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất: zeatin riboside

- Tên hóa học:\r\n6-[(E)-4-Hydroxy-3-methylbut-2-enylamino]-9-β-D-ribofuranosylpurine

- Công thức phân tử: C₁₅H₂₁N₅O₅

- Khối lượng phân tử: 351,37

A.3  Giới thiệu hoạt chất cytokinin\r\nkinetin

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất: cytokinin kinetin

- Tên hóa học: IUPAC: N⁶-furfuryladenine

- Công thức phân tử: C₁₀H₉N₅O

- Khối lượng phân tử: 215,56

- Nhiệt độ nóng chảy: 269 °C đến 271 °C 12

A.4  Giới thiệu hoạt chất cytokinin\r\nbenzylaminopurine

- Công thức cấu tạo:

- Tên hoạt chất: cytokinin benzylaminopurine

- Tên hóa học: IUPAC: N-(Phenylmethyl)-7H-purin-6-amine

- Công thức phân tử: C₁₂H₁₁N₅

- Khối lượng phân tử: 225,25

A.5  Hiệu suất thu hồi và giới hạn\r\nđịnh lượng

- Hiệu suất thu hồi của phương pháp: từ 80 %\r\nđến 110 %.

- Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ):

- Zeatin: 5 mg/kg

- Zeatin riboside: 5 mg/kg

- Kinetin: 5 mg/kg

- Benzylaminopurine: 2,5 mg/kg

- Độ lặp lại của phương pháp, CV ≤ 7 %.

Phụ\r\nlục B

(Tham\r\nkhảo)

Thông tin về sắc ký đồ điển hình của nhóm\r\ncytokinins

THƯ MỤC TÀI\r\nLIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 12017: 2017 Thuốc bảo vệ thực\r\nvật- Lấy mẫu

[2] Danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép\r\nsử dụng ở Việt Nam.

[3] Manual pesticides

[4] Analysis of cytokinins by immunoassay and\r\nhigh performance liquid chromatography of in vitro cultivated dianthus\r\ncaryophyllus, bulg.J.PIant physiol., 1996, 22(3-4), 95-104

[5] New Methods of Qualitative and\r\nQuantitative Analysis of Cytokinins, Michal Karády

[6] Analytical methods for cytokinins, Petr\r\nTarkowski, Liya Ge, Jean Wan Hong Yong, Swee Ngin Tan, Trends in Analytical\r\nChemistry, Vol. 28, No. 3, 2009