TIÊU CHUẨN\r\nNGÀNH

10TCN\r\n833:2006

THỨC\r\nĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHLOTETRACYCLINE, OXYTETRACYLINE VÀ\r\nTETRACYCLINE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal\r\nfeeding stuffs - Determination of content of chlotetracycline, oxytetracycline\r\nand tetracycline by high - performance liquid chromatographic method

(Ban hành kèm theo\r\nQuyết định số 4099/QĐ/BNN-KHCN ngày 29 tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông\r\nnghiệp và Phát triển nông thôn)

1.\r\nPhạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy\r\nđịnh phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng các\r\nkháng sinh chlotetracycline (CTC), oxytetracycline (OTC) và tetracycline (TC)\r\ntrong thức ăn chăn nuôi. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,1 mg/kg.

2.\r\nTài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn\r\nsau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện\r\ndẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện\r\ndẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa\r\nđổi:

TCVN 4851 (ISO 3696).\r\nNước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp\r\nthử.

ISO 6497:2002 (E):\r\nAnimal feeding stuffs - Sampling.

3.\r\nNguyên tắc

Các kháng sinh nhóm\r\ntetracycline trong mẫu thức ăn chăn nuôi được chiết bằng dung dịch đệm ở pH 4.\r\nDịch chiết được làm sạch bằng cột chiết pha rắn RP - C18. Các tetracycline được\r\ntách và định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector\r\nUV ở bước sóng 350 nm.

4.\r\nThiết bị, dụng cụ

4.1. Máy nghiền mẫu\r\nphòng thí nghiệm.

4.2. Sàng phòng thí\r\nnghiệm, có kích thước lỗ sàng 1,00 mm và 3,00 mm.

4.3. Cân phân tích có\r\nđộ chính xác 0,0001 g.

4.4. Cân kỹ thuật có\r\nđộ chính xác 0,01 g.

4.5. Máy ly tâm có\r\ntốc độ 3000 vòng/phút, sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml.

4.6. ống ly tâm, dung\r\ntích 50 ml bằng polypropylen hoặc bằng thuỷ tinh, có nắp đậy.

4.7. Máy nghiền đồng\r\nthể (Homorgenizer).

4.8. Máy lắc tròn\r\nhoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độ 250 vòng/phút.

4.9. Máy đo pH có độ\r\nchính xác đến 0,05 đơn vị.

4.10. Phễu lọc\r\nBuchner đường kính 5,5 cm.

4.11. Giấy lọc tốc độ\r\nnhanh.

4.12. Bình định mức\r\ndung tích 10, 100, 500, 1000 ml.

4.13. Pipet tự động\r\nđiều chỉnh được từ 2 ml đến 10 ml.

4.14. Micropipet dung\r\ntích từ 10 ml đến 100 ml.

4.15. Hút dung môi tự\r\nđộng 2 ml, 10 ml, 20 ml.

4.16. Bể siêu âm.

4.17. Bơm  hút chân\r\nkhông.

4.18  Màng lọc syranh\r\ncó kích thước 0,45 àm.

4.19. Lọ nhỏ đựng\r\ndịch mẫu chuyên dụng cho HPLC, có nắp vặn PTFE .

4.20. Thiết bị trộn\r\nmẫu phòng thí nghiệm loại Hobart Model C 100 T hoặc tương đương.

4.21. Thiết bị chia\r\nmẫu:

Thiết bị chia đôi\r\nhoặc chia tư mẫu: ví dụ như thiết bị chia tư hình nón, thiết bị chia nhiều ngăn\r\ncó hệ thống phân hạt hoặc các thiết bị chia khác đảm bảo phân chia mẫu thí\r\nnghiệm thành mẫu thử đồng nhất.

4.22. Hộp đựng mẫu có\r\nnắp kín.

4.23. Hệ thống HPLC\r\ngồm có:

4.23.1. Máy sắc kí\r\nlỏng hiệu năng cao, bình chứa dung môi, hệ thống bơm mẫu, Detector UV đặt được\r\nở bước sóng 350nm, máy ghi hoặc bộ tích phân.

4.23.2. Cột phân tích\r\nHPLC pha đảo có kèm cột bảo vệ

- Chiều\r\ndài                         250mm

- Đường kính\r\ntrong             4,6mm

- Hạt\r\nnhồi                           C 18, 5mm\r\nhoặc tương đương

Chú ý : có thể sử dụng cột\r\nngắn hơn, ví dụ có chiều dài 120mm-150mm.

5. Hoá chất và thuốc thử

5.1 Hoá chất

Chỉ sử dụng hoá chất\r\nđược công nhận đạt chất lượng tinh khiết phân tích và nước cất cấp hạng 1 theo\r\nTCVN 4851 (ISO 3696). Các dung môi phải đạt chất lượng để dùng cho phân tích\r\nHPLC.

5.1.1. Natri\r\nhydrophotphat khan (Na₂HPO₄).

5.1.2. axit xitric\r\nngậm 1 phân tử nước (C₆H₈O₇.H₂O).

5.1.3. axit oxalic\r\nngậm 2 phân tử nước (H₂C₂O₄.2 H₂O).

5.1.4. Dinatri etylen\r\ndiamin tetraaxetat ngậm 2 phân tử nước (Na₂EDTA. 2H₂O).

5.1.5. Metanol.

5.1.6. axetonnitrile.

5.1.7. Natri\r\nhydroxit.

5.1.8. axit\r\nclohydric.

5.1.9. Chất chuẩn\r\nkháng sinh nhóm tetracycline bao gồm: chlotetracycline hydrocloride (CTC),\r\noxytetracyclin  hydrochlorid (OTC) và tetraclohydrochlorid (TC) loại tinh khiết\r\ncó kèm theo giấy chứng nhận về hàm lượng.

5.2. Thuốc thử

5.2.1. Dung dịch đệm\r\nMcILvaine (pH 4 ± 0,05):

Dung dịch A: Cân 14,2\r\ngam natri hyđrophotphat khan cho vào bình định mức dung tích 500 ml, hoà tan và\r\nđịnh mức đến vạch bằng nước cất, lắc đều

Dung dịch B: Cân 10,5\r\ngam axit xitric ngậm 1 phân tử nước cho vào bình định mức dung tích 500 ml, hoà\r\ntan và định mức đến vạch bằng nước cất, lắc đều

Dung dịch đệm\r\nMcILvaine (pH 4 ± 0,05): Lấy 312,5 ml dung dịch A và 500 ml dung dịch B cho vào\r\nbình định mức 1000 ml, lắc đều. Sử dụng máy đo pH điều chỉnh pH của dung dịch\r\ntrong bình đến pH 4 ± 0,05 bằng dung dịch HCl 0,1M hoặc dung dịch NaOH 0,1M.\r\nDung dịch sử dụng trong một tuần.

5.2.2. Dung dịch đệm McILvaine\r\n- EDTA: Hoà tan 30,25 gam dinatri etylen diamin tetra axetat ngậm 2 phân tử\r\nnước vào 812,5 ml dung dịch đệm McILvaine (5.2.1), lắc đến tan hết và trộn đều.\r\nDung dịch sử dụng trong một tuần.

5.2.3. Dung dịch axit\r\noxalic trong metanol: Cân 1,26 gam axit oxalic ngậm 2 phân tử nước cho vào bình\r\nđịnh mức dung tích 1000 ml, hoà tan và định mức đến vạch bằng methanol, lắc\r\nđều. Dung dịch này sử dụng trong ngày.

5.2.4. Pha động cho\r\nHPLC: Cân 1,26 gam Axit oxalic ngậm 2 phân tử nước vào bình định mức 1000 ml,\r\nhoà tan và định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều. Trộn 600 ml dung dịch axit\r\noxalic này với 300 ml axetonnitril và 100 ml metanol, lọc hỗn hợp dung dịch thu\r\nđược qua màng lọc 0,45 àm (lọc chân không), siêu âm đuổi khí ở nhiệt độ phòng\r\ntrong 30 phút. Dung dịch này sử dụng trong ngày.

5.2.5. Dung dịch\r\nkháng sinh chuẩn:

CHÚ Ý: Việc pha các\r\ndung dịch chuẩn phải được tiến hành ở điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp và bảo\r\nquản trong lọ sẫm màu.

5.2.5.1. Dung dịch\r\nchuẩn gốc 1000 µg/ml:

Cân 108 mg (chính xác\r\nđến 0,1mg) mỗi loại chuẩn gồm CTC, OTC, TC cho vào 3 bình định mức riêng biệt\r\ndung tích 100 ml (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi trong\r\ngiấy chứng nhận). Hoà tan và định mức đến vạch bằng metanol, lắc đều.

Các dung dịch chuẩn\r\ngốc được bảo quản ở - 20⁰C, có thể sử dụng những dung dịch này trong\r\nvòng 3 tháng.

5.2.5.2. Dung dịch\r\nchuẩn gốc hỗn hợp 100 µg/ml:

Hút chính xác 10 ml\r\nmỗi dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/ml (5.2.5.1) vào bình định mức 100 ml, định mức\r\nđến vạch bằng metanol, lắc đều.

5.2.5.3. Dung dịch\r\nchuẩn làm việc 25 µg/ml:

Hút chính xác 2,5 ml\r\ndung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml (5.2.5.2) vào bình định mức 100 ml, định mức\r\nđến vạch bằng metanol, lắc đều.

Bảo quản dung dịch\r\ntrong tủ lạnh, dung dịch bền trong 1 tuần.

5.2.5.4. Dãy dung dịch\r\nchuẩn phân tích sắc ký 0,25; 0,50; 1,25; 2,50 và 5,00 µg/ml:

Hút chính xác 100,\r\n200, 500, 1000, 2000 ml dung dịch chuẩn làm\r\nviệc 25 àg/ml (5.2.5.3) của hỗn hợp các tetracyclin cho vào bình định mức dung\r\ntích 10 ml. Thêm 6 ml dung dịch axit oxalic trong metanol (5.2.3) và định mức\r\nđến vạch bằng nước cất, lắc đều.

Bảo quản dung dịch\r\ntrong tủ lạnh, dung dịch này bền trong 1 tuần.

5.2.6 Dung dịch HCl\r\n0,1 M

5.2.7. Dung dịch NaOH\r\n0,1 M

6.\r\nLấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1. Lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu\r\nkhông quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo ISO 6497:2002. Điều quan\r\ntrọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải là mẫu trung thực và có tính đại\r\ndiện, không bị hư hại hoặc bị biến đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và\r\nbảo quản. Khối lượng mẫu phân tích phải không được ít hơn 500 gam.

6.2. Chuẩn bị mẫu

6.2.1. Mẫu ở dạng bột\r\nmịn

Nếu mẫu thí nghiệm ở\r\ndạng bột lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm thì trộn thật đều\r\nmẫu (500 gam) bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong\r\nvòng 10 phút. Sau đó chia hỗn hợp bằng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư\r\ncho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam. Cho toàn bộ mẫu thử vào\r\nhộp đựng mẫu và đậy nắp cẩn thận.

6.2.2. Mẫu có kích\r\nthước hạt vừa

6.2.2.1. Nếu mẫu thí\r\nnghiệm không lọt hết qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm nhưng lọt hoàn toàn\r\nqua sàng có kích thước lỗ 3,00 mm thì trộn thật đều mẫu (không ít hơn 500 gam)\r\nbằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.

6.2.2.2. Dùng thiết\r\nbị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu đã trộn đều (6.2.2.1) cho đến khi thu\r\nđược lượng mẫu thử không dưới 100 gam. Nghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy\r\nnghiền (4.1) cho dến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00\r\nmm.

6.2.3. Mẫu có kích\r\nthước hạt to

6.2.3.1. Nếu mẫu\r\nkhông lọt qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm thì cần nghiền mẫu (không ít\r\nhơn 500 gam) trên máy nghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có\r\nkích thước lỗ sàng 3,00 mm, sau đó trộn thật đều mẫu bằng máy trộn phòng thí\r\nnghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.

6.2.3.2. Dùng thiết\r\nbị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu đã trộn đều (6.2.3.1) cho đến khi thu\r\nđược lượng mẫu thử không dưới 100 gam. Nghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy\r\nnghiền (4.1) cho  đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00\r\nmm.

Mẫu thử được bảo quản\r\ntrong các lọ đựng mẫu (4.22) ở điều kiện nhiệt độ 2 – 25⁰C, nơi khô\r\nráo.

Chú ý: Nên nghiền,\r\ntrộn mẫu trong các phòng có thông gió, nên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo\r\nvệ.

7.\r\nCách tiến hành

7.1. Chiết mẫu

7.1.1. Cân chính xác\r\nđến 0,01g từ 1 – 5 gam mẫu đã được nghiền mịn theo mục 6 (tuỳ theo hàm lượng\r\nkháng sinh có trong mẫu) cho vào ống ly tâm dung tích 50 ml (ống ly tâm 1),\r\nthêm tiếp 20 ml dung dịch đệm McILvaine – EDTA (5.2.2), làm đồng nhất mẫu trong\r\n1 phút bằng máy nghiền đồng thể. Tráng rửa đầu máy nghiền đồng thể 2 lần, mỗi\r\nlần bằng 2 ml dung dịch đệm McILvaine – EDTA. Đậy nắp ống ly tâm  và lắc ống\r\ntrong 10 phút ở tốc độ cao. Chuyển ống vào máy ly tâm, ly tâm trong 10 phút ở\r\ntốc độ 3000 vòng/phút.

7.1.2. Gạn phần dịch\r\ntrong phía trên ống ly tâm 1 vào một ống ly tâm khác (ống ly tâm 2). Thêm tiếp\r\n20 ml dung dịch đệm McILvaine – EDTA (5.2.2) vào ống ly tâm 1, đậy nắp, lắc\r\ntrong 10 phút và ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Tiếp tục gạn\r\nphần dịch trong phía trên ống ly tâm 1 vào ống ly tâm 2. Sau đó lại thêm 10 ml\r\ndung dịch đệm McILvaine – EDTA (5.2.2) vào ống ly tâm 1, lắc và ly tâm như trên\r\nvà gạn tiếp phần dịch trong phía trên ống ly tâm 1 vào ống ly tâm 2.

7.1.3. Ly tâm ống ly\r\ntâm 2 trong 20 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Sau đó lọc bằng chân không qua\r\ngiấy lọc trên phễu Buchner vào bình tam giác 125 ml. Tráng rửa ống ly tâm và phễu lọc 2 lần, mỗi lần bằng 2\r\nml dung dịch đệm McILvaine – EDTA (5.2.2).

7.2. Chuẩn bị mẫu\r\ntrắng

Mẫu trắng là mẫu thức\r\năn chăn nuôi được xác định là không có kháng sinh nhóm tetracyclin. Mẫu trắng\r\nđược chuẩn bị tương tự như mẫu thử theo 7.1.

7.3. Chuẩn bị mẫu để\r\nxác định độ thu hồi

Mẫu này được bổ sung\r\nmột lượng kháng sinh xấp xỉ dung dịch chuẩn gốc. Ví dụ, chuẩn bị dịch mẫu thu\r\nhồi có hàm lượng kháng sinh là 1 mg/kg: dùng pipet hút 200 ml dung dịch chuẩn làm việc 25 àg/ml\r\n(5.2.5.3) cho vào 5 gam mẫu trắng (7.2) và tiếp tục quá trình chiết mẫu tương\r\ntự như đối với mẫu thử (7.1).

7.4. Làm sạch

7.4.1. Nối cột SPE -\r\nC18 với đầu ra của một syranh thuỷ tinh dung tích 100 ml, rửa cột bằng 20 ml\r\nmetanol, sau đó bằng 20 ml nước cất, loại bỏ dịch qua cột.

7.4.2. Lần lượt cho\r\ncác dịch chiết trong ống ly tâm thu được từ 7.1.3, 7.2 và 7.3 qua syranh vào\r\ncột SPE - C18 đã được chuẩn bị ở trên, dùng bơm hút chân không và điều chỉnh\r\ntốc độ chảy không quá 2ml/phút. Tráng ống li tâm bằng 10 ml dung dịch đệm\r\nMcILvaine - EDTA (5.2.2) và chuyển hết vào cột SPE – C18, không để cột bị\r\nkhô trong giai đoạn này, rửa cột bằng 20 ml nước cất và tiếp tục hút chân\r\nkhông để làm khô cột thêm 2 phút.

7.4.3. Rửa giải các\r\nkháng sinh trong cột SPE - C18 bằng cách cho 6 ml dung dịch axit oxalic trong\r\nmethanol (5.2.3) chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/phút. Thu dịch qua khỏi cột vào\r\nbình định mức 10 ml. Sau khi dịch rửa giải chảy hết, tiếp tục hút chân không\r\nthêm khoảng 10 giây để đảm bảo thu hết được dịch rửa giải. Định mức dịch thu\r\nđược đến vạch bằng nước cất, lắc đều, sau đó lọc qua màng lọc 0,45 àm vào lọ\r\nnhỏ chuyên dụng cho HPLC (4.19) để phân tích trên hệ thống  sắc kí.

7.5. Tiến hành trên\r\nHPLC

7.5.1. Điều kiện chạy\r\nmáy

Tốc độ dòng                                        1\r\nml/phút

Nhiệt độ cột                                          nhiệt\r\nđộ phòng

Detector                                               detector\r\nUV bước sóng 350 nm

Thể tích bơm mẫu                                 50\r\nml

7.5.2. Tiến hành

7.5.2.1.\r\nNên sử dụng bảo vệ cột, việc sử dụng bảo vệ cột không có bất cứ ảnh hưởng nào\r\nđến kết quả phân tích.

7.5.2.2.\r\nCân bằng hệ thống sắc ký bằng pha động 30 phút trước khi bơm mẫu.

7.5.2.3. Quy trình\r\nbơm mẫu theo thứ tự như sau:

- Dịch mẫu trắng

- Dung dịch chuẩn làm\r\nviệc

- Dịch mẫu thu hồi

- Dịch mẫu thử

- Dung dịch chuẩn làm\r\nviệc

Chú ý: Cần bơm các\r\ndịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, không nên để quá 20 lần bơm mẫu cho\r\nmỗi đợt phân tích. Nếu quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm lần nữa\r\nvào khoảng giữa đợt bơm mẫu.

7.5.2.4. Xác định\r\ndiện tích (hoặc chiều cao) pic đối với các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử\r\ntương ứng

7.5.2.5. Sau khi chạy\r\nmáy phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm nước cất : axetonnitril :\r\nmethanol theo tỷ lệ thể tích 7 : 2 : 1 trong 30 phút.

8.\r\nTính toán kết quả

8.1. Đường chuẩn

8.1.1. Phải đảm bảo\r\nrằng các diện tích pic của mẫu thử đều nằm trong phạm vi của đường chuẩn. Nếu\r\nmẫu thử nào có diện tích pic vượt quá diện tích của đường chuẩn ở nồng độ cao\r\nnhất thì sẽ bị loại và phải tiến hành thử lại với sự pha loãng.

8.1.2. Xây dựng đường\r\nchuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn với\r\nnồng độ của từng loại theo quan hệ tuyến tính bậc 1:

y = ax + b

Trong đó:          y\r\nlà diện tích pic (hoặc chiều cao của pic).

                        x\r\nlà nồng độ của kháng sinh.

                        a\r\nlà hệ số góc.

                        b\r\nlà hằng số.

8.2. Tính toán

8.2.1. Hàm lượng các\r\nkháng sinh có trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn hồi qui tuyến\r\ntính (8.1.2) theo công thức sau:

Trong đó:          X\r\nlà hàm lượng kháng sinh có trong mẫu thử, tính bằng mg/kg.

                        Y\r\nlà hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết mẫu thử và diện tích pic của mẫu\r\ntrắng.

                        a,\r\nb là các thông số của đường chuẩn y = ax + b

                        V là thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch\r\n(7.4.3), tính bằng ml

                        m\r\nlà khối lượng mẫu thử, tính bằng gam.

8.2.2. Kết quả cuối\r\ncùng là giá trung bình của hai lần phân tích nhắc lại. Trong quá trình tính\r\ntoán luôn phải lấy hai số sau dấu phẩy. Giá trị trung bình được làm tròn đến\r\nmột chữ số thập phân.

8.2.3. Xác định độ\r\nthu hồi (R) theo công thức sau:

Trong đó:         

C₁ là hàm\r\nlượng tetracyline xác định được theo quy trình phân tích (tính bằng

mg/kg).

C là hàm lượng\r\ntetracyline được nạp thêm vào mẫu (1,25 mg/kg).

Độ thu hồi được xác\r\nđịnh cho mỗi lần chạy mẫu ít nhất phải đạt 80%.

9.\r\nBáo cáo thử nghiệm

 Báo cáo kết quả phải\r\nbao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

- Mọi thông tin cần\r\nthiết để nhận biết mẫu thử.

- Viện dẫn của tiêu\r\nchuẩn này hoặc phương pháp thử.

- Kết quả và đơn vị\r\nbiểu thị kết quả.

- Ngày tháng lấy mẫu\r\nvà kiểu loại lấy mẫu (nếu có).

- Ngày tháng thử\r\nnghiệm.

- Các điểm đặc biệt\r\nquan sát được trong quá trình thử nghiệm.

- Mọi thao tác không\r\nqui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với các chi tiết\r\ncủa sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.