TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13851:2023
ASTM D7584 - 16 (2021)

DA - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM TRÊN BỀ MẶT DA PHÈN XANH VÀ DA PHÈN TRẮNG TRONG BUỒNG MÔI TRƯỜNG

Evaluating the resistance of the surface of wet blue and wet white to the growth of fungi in an environmental chamber

Lời nói đầu

TCVN 13851:2023 được xây dựng trên cơ sở chấp nhận hoàn toàn tương đương với ASTM D47584 - 16 (Reapproved 2021) Evaluating the resistance of the surface of wet blue and wet white to the growth of fungi in an environmental chamber với sự cho phép của ASTM quốc tế, 100 Barr Harbor Drive, West Conshohocken, PA 19428, USA. Tiêu chuẩn ASTM D4576 - 16 (Reapproved 2021) thuộc bản quyền của ASTM quốc tế.

TCVN 13851:2023 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 120 biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

DA - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM TRÊN BỀ MẶT DA PHÈN XANH VÀ DA PHÈN TRẮNG TRONG BUỒNG MÔI TRƯỜNG

Evaluating the resistance of the surface of wet blue and wet white to the growth of fungi in an environmental chamber

1  Phạm vi áp dụng

1.1  Tiêu chuẩn này quy định phương pháp buồng môi trường nhằm xác định khả năng chống lại sự nảy mầm của bào tử và sự phát triển sinh dưỡng tiếp theo trong khoảng thời gian bốn tuần của da phèn xanh và da phèn trắng đã qua xử lý. Phương pháp thử này hữu ích trong việc ước tính hiệu quả của thuốc diệt nấm và hỗ trợ dự đoán thời gian bảo quản của da phèn xanh và da phèn trắng trước khi nấm bắt đầu phát triển. Thiết bị, dụng cụ được thiết kế để bất kỳ bên quan tâm nào cũng có thể dễ dàng thực hiện hoặc có được và mô phỏng môi trường tự nhiên mà trong đó da phèn xanh và da phèn trắng được cấy các bào tử nấm. Các bào tử nảy mầm trên da phèn xanh và da phèn trắng chưa được xử lý hoặc đã xử lý có thể tạo ra sự phát triển của nấm, dẫn đến làm da bị biến dạng hoặc đổi màu, hoặc cả hai.

1.2  Các giá trị tính theo đơn vị SI là giá trị tiêu chuẩn. Tiêu chuẩn này không sử dụng hệ đơn vị khác.

1.3  Tiêu chuẩn này không nhằm mục đích giải quyết tất cả các mối quan tâm về an toàn, nếu có, liên quan đến việc sử dụng. Người sử dụng tiêu chuẩn này có trách nhiệm thiết lập các thực hành về an toàn, sức khỏe và môi trường phù hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

ASTM D3273, Standard Test Method For Resistance To Growth Of Mold On The Surface Of Interior Coatings In An Environmental Chamber (Phương pháp xác định khả năng chống lại sự phát triển của nấm mốc trên bề mặt sơn nội thất trong phòng thử)

ASTM E177 Standard Practice For Use Of The Terms Precision And Bias In ASTM Test Methods (Quy định việc sử dụng các thuật ngữ độ chính xác và độ chệch trong các phương pháp thử nghiệm của ASTM)

ASTM E691 Practice for Conducting an Interlaboratory stud Determine the Precision of a Test Method (Phương pháp nghiên cứu liên phòng thí nghiệm xác định độ chụm của phương pháp thử)

3  Thuật ngữ và định nghĩa

3.1

Nấm (fungi)

Sinh vật nhân chuẩn hóa dưỡng sinh sống chủ yếu trong điều kiện hiếu khí và tạo ra năng lượng bằng quá trình oxy hóa các vật liệu hữu cơ

3.2

Nấm mốc (mold)

Sự đổi màu quan sát được bằng mắt thường của bề mặt da phèn xanh. Nấm mốc cũng là một dấu hiệu cho thấy sự hiện diện của vi nấm phát triển dưới dạng sợi nấm thường từ màu trong suốt đến màu trắng, bào tử có nhiều màu và cấu trúc khác nhau. Các đốm màu, có thể là do sự có mặt của sắc tố màu do nấm tạo ra, quan sát được trên bề mặt da phèn xanh ở những vị trí nấm đã phát triển và sau đó dừng phát triển, có thể quan sát cấu trúc nấm như sợi nấm và các bào tử bằng kính lúp cầm tay đơn giản có độ phóng đại 10x.

3.3

Da phèn xanh (Wet Blue)

Con da to hoặc con da nhỏ, hoặc da váng của con da to hoặc con da nhỏ, được thuộc bazơ crom sulfat, độ ẩm 50 % và độ pH có tính axit.

3.4

Da phèn trắng (Wet White)

Con da to hoặc con da nhỏ đã được xử lý thuộc da ở bước cuối cùng bằng cách sử dụng các chất thuộc da hữu cơ hoặc không-hữu cơ. Các tác nhân có chứa crom hoặc sắt và các chất chiết xuất từ thực vật sẽ không được sử dụng trong da phèn trắng.

3.5  Các loại nấm quan trọng trong cơ sở thuộc da

3.5.1

Nấm sợi (Filamentous Fungi)

(1) Nhiều loại nấm đã được xác định trong cơ sở thuộc da, nhưng các loài thường gặp bao gồm Aspergillus spp., Paecilomyces spp., và Penicillium spp.

(2) Aspergillus niger tạo bào tử màu đen và Penicillium luteum tạo bào tử màu xanh lục vàng

(3) Trichoderma viride tạo bào tử xanh.

3.5.2

Nấm men (yeast)

Nhiều loại nấm men có màu kem, nhưng cũng có thể gặp những loại nấm men có sắc tố bao gồm Rhodotorula sp, tạo sắc tố đỏ.

3.5.3  Các yếu tố thúc đẩy sự phát triển của nấm trong cơ sở thuộc da:

(1) Da phèn xanh và da phèn trắng chứa các chất dinh dưỡng có lợi cho sự phát triển của nấm.

(2) Các yếu tố môi trường thuận lợi bao gồm độ pH axit nhẹ, độ ẩm cao và nhiệt độ ấm.

(3) Bào tử nấm theo đường không khí hoặc trên các con da vào cơ sở thuộc da và phát tán trong cơ sở thuộc da bằng cách tiếp xúc vật lý hoặc không khí với các chất nền thuận lợi cho sự phát triển bao gồm da phèn xanh và da phèn trắng.

4  Phương tiện bảo vệ cá nhân

4.1  Nấm là sinh vật cơ hội. Do đó, phải đeo găng tay cao su hoặc găng tay latex không bột, kính bảo hộ và áo khoác phòng thí nghiệm bất cứ khi nào xử lý các mẫu có nấm phát triển.

4.2  Phải đeo mặt nạ chống bụi hoặc mặt nạ phòng độc bất cứ khi nào buồng môi trường mở hoặc bất cứ khi nào tiếp xúc với các mẫu có nấm phát triển.

4.2.1  Mặt nạ chống bụi, ví dụ, Khẩu trang 3M 8210 và 3M 9322.

4.2.2  Khẩu trang nửa mặt, được trang bị bộ lọc hiệu quả 99,97% chống lại các hạt rắn hoặc lỏng bao gồm các hạt gốc dầu. Ví dụ, khẩu trang nửa mặt dòng North 7700 được trang bị Bộ lọc Cartridge PI 00.

5  Tóm tắt phương pháp đánh giá

5.1  Da phèn xanh hoặc da phèn trắng được treo trong buồng có môi trường ẩm, ấm.

5.2  Sau khi ủ trong bảy ngày, toàn bộ diện tích mặt cật và mặt thịt của mẫu thử được kiểm tra bằng mắt thường, trước hết là một mặt, ví dụ, mặt cật, sau đó đến mặt còn lại, ví dụ, mặt thịt. Sự phát triển của nấm được đánh giá bằng thang số từ 10 (sạch hoặc không có dấu hiệu của sự phát triển của nấm) đến 0 (bị nấm phát triển che phủ hoàn toàn).

5.3  Bước B được lặp lại một lần mỗi tuần cho đến khi hoàn thành xếp hạng cho tất cả các mẫu ở 14, 21 và 28 ngày tiếp xúc trong buồng môi trường.

5.4  Sau khi kết thúc lần đọc hàng tuần thứ tư, chuẩn bị báo cáo kết quả và chuyển cho bên yêu cầu đánh giá.

6  Ý nghĩa và sử dụng

6.1  Phương pháp buồng môi trường là một phép thử gia tốc để xác định khả năng chống lại sự phát triển của nấm của da phèn xanh và da phèn trắng, tác nhân gây ra nấm mốc. Xem ASTM D3273[1],[2]

6.2  Phương pháp buồng môi trường hữu ích trong việc ước tính hiệu suất của thuốc diệt nấm và sẽ hỗ trợ dự đoán thời gian bảo quản trước khi nấm bắt đầu phát triển.

Hình 1 - Buồng môi trường

6.3  Phương pháp buồng môi trường mô phỏng môi trường tự nhiên trong đó da phèn xanh hoặc da phèn trắng được cấy các bào tử nấm và sau đó bị biến dạng hoặc biến màu bởi nấm.

6.4  Phương pháp buồng môi trường đo mức độ kháng lại của da phèn xanh hoặc da phèn trắng đã qua xử lý đối với sự nảy mầm của bào tử và sự phát triển sinh dưỡng tiếp theo lan rộng trên bề mặt của mẫu da phèn xanh hoặc da phèn trắng trong khoảng thời gian bốn tuần.

6.5  Buồng môi trường có thể được cấy các loại nấm đại diện cho những loại nấm được tìm thấy trong các cơ sở thuộc da bằng cách thêm các mẫu da phèn xanh và da phèn trắng có sự phát triển của nấm từ các cơ sở thuộc da hiện đang hoạt động.

6.6  Các mẫu đối chứng da phèn xanh và da phèn trắng mà không cần xử lý thuốc diệt nấm có thể được thêm vào buồng định kỳ để tăng mức độ phát triển của nấm trong buồng thử.

6.7  Việc rửa trôi chất diệt nấm từ mẫu thử vào thạch thường gây ra vùng ức chế sự phát triển của nấm trong phép thử trên đĩa petri, nhưng trong buồng môi trường, chất diệt nấm bất kỳ được rửa trôi từ mẫu thử sẽ nhỏ vào nước chứa trong buồng và do đó, không gây ra kết quả đọc sai quan sát được trong phép thử đĩa petri.

7  Nhiễu

7.1  Sự gây nhiễu phổ biến là làm ô nhiễm mẫu bởi các sinh vật không mong muốn, ví dụ như động vật chân đốt - bao gồm bọ ve và nấm mốc xâm nhập vào buồng môi trường, trên các mẫu thử hoặc từ môi trường phòng thí nghiệm.

7.1.1  Bọ ve (Acari bao gồm Tyroglyphus và Tarsonemus):

7.1.1.1  Bọ ve xâm nhập vào khoang môi trường ăn các sợi nấm trên mẫu thử, lây nhiễm vi khuẩn cho chúng và lan từ mẫu thử này sang mẫu thử khác làm ô nhiễm mẫu.

7.1.1.2  Bọ ve phát triển mạnh trong môi trường có nhiệt độ và độ ẩm cao.

7.1.1.3  Bọ ve bị thu hút bởi mùi nấm và cũng có thể được đưa vào buồng môi trường trên xác ruồi, vật chất hữu cơ, đất, và cả các mẫu thử.

7.1.1.4  Phải thực hiện các biện pháp phòng ngừa và vệ sinh chung để kiểm soát bọ ve, bao gồm kiểm tra tất cả các vật liệu mới vào phòng thí nghiệm và duy trì các phòng riêng biệt để xử lý ban đầu các mẫu mới để thử và một phòng sạch để chứa buồng môi trường.

7.1.2  Ruồi nấm (Sciaroidea - bao gồm ruồi nấm cánh sẫm, Sciaridae):

7.1.2.1  Ấu trùng của nấm mốc được biết là sống ở bất cứ nơi nào nấm mọc.

7.1.2.2  Các biện pháp phòng ngừa và vệ sinh chung tương tự được sử dụng để kiểm soát bọ ve cũng áp dụng cho việc kiểm soát các loài nấm mốc, đặc biệt là giữ cho phòng chứa các buồng môi trường luôn sạch sẽ.

7.1.3  Nếu bọ ve hoặc mạt nấm xuất hiện trong buồng môi trường, phải dừng công việc đang tiến hành, loại bỏ tất cả các mẫu và đất, khử trùng tất cả các bề mặt cứng và bắt đầu lại quá trình khởi động buồng.

7.2  Hạn chế ánh nắng chiếu vào buồng và chỉ bật đèn phòng khi làm việc trong phòng để ngăn tảo phát triển.

8  Thiết bị và dụng cụ (xem Hình 1 và Hình 2)

8.1  Một buồng môi trường điển hình phải bao gồm các chi tiết sau (tất cả các phép đo được làm tròn chính xác đến từng cm và có thể thay đổi kích thước từ thiết kế buồng):

8.1.1  Buồng được đặt cao hơn mặt sàn, có thể di động bằng cách đặt trên một bệ thép có bánh xe và được kết cấu đủ khỏe để chịu được trọng lượng buồng, đất, nước và mẫu. Bệ phẳng điển hình kích thước 97 cm × 66 cm × 66 cm (chiều dài × chiều rộng × chiều cao), có chân thép và bánh xe nâng buồng cao hơn 36 cm so với mặt sàn.

8.1.2  Một bể hình chữ nhật được sử dụng để chứa đất, nước và các mẫu.

8.1.2.1  Một bể thông thường có kích thước 94 cm × 62 cm × 62 cm (chiều dài × chiều rộng × chiều cao), độ dày thành 1 cm. Bể được chế tạo kín nước. Kích thước bên trong của bể là 91 cm × 61 cm × 61 cm (chiều dài × chiều rộng × chiều cao). Mực nước ở đáy bể được duy trì ở độ cao từ 8 cm đến 17 cm.

8.1.2.2  Bể có vai bù ở vành trên. Điều này có tác dụng hỗ trợ đậy buồng khi ở vị trí đóng, để chứa nước nhỏ giọt từ nắp buồng và chuyển nước trở lại đáy bể mà không nhỏ giọt lên các mẫu da phèn xanh và da phèn trắng. Vành tạo cho đỉnh của bể có chiều dài mở rộng là 104 cm, chiều rộng mở rộng là 72 cm và thành bên ngoài nâng cao 3,8 cm.

Mặt trong của vành giảm 3,6 cm so với mặt trên của bể tạo một khung ngang có chiều rộng 5 cm có hình thác nước uốn lượn hướng nước chảy xuống đáy bể.

8.1.3  Một khay đất hình chữ nhật được sử dụng để chứa hỗn hợp đất và chất cấy. Xem Hình 3 và Hình 4.

8.1.3.1  Khay đất được đặt trên mặt bàn để nâng khay lên trên mực nước.

8.1.3.2  Kích thước của khay đất có kích thước 82 cm × 56 cm × 5 cm (chiều dài × chiều rộng × chiều cao).

8.1.3.3  Đáy khay đặt một tấm lưới kim loại chống ăn mòn. Nếu cần, đặt một lớp sàng lọc bằng nhựa hoặc sợi thủy tinh trên lưới kim loại để giữ đất cố định.

8.1.3.4  Mục đích chính của khay đất là giúp giữ ẩm đều cho buồng môi trường.

8.1.4  Một khung đỡ hình chữ nhật được đặt gần đỉnh buồng môi trường và dùng để giữ các thanh treo các mẫu da phèn xanh hoặc da phèn trắng. Xem Hình 5. Khung này sẽ cung cấp đủ không gian thanh treo để treo 100 hoặc nhiều hơn mẫu da phèn xanh và da phèn trắng. Buồng môi trường có thể được thiết kế để cung cấp không gian cho số lượng mẫu nhiều hơn phù hợp với nhu cầu của phòng thử nghiệm.

Hình 2 - Sơ sồ buồng môi trường

8.1.4.1  Khung có kích thước 90 cm × 58 cm × 8 cm (chiều dài × chiều rộng × chiều cao), dày 2 cm.

8.1.4.2  Bốn giá đỡ hình chữ L giữ cố định khung và mỗi giá đỡ có kích thước 5 cm × 2 cm × 0,6 cm (chiều dài × chiều rộng × chiều cao). Các giá đỡ được gắn chặt vào thành buồng môi trường bằng các phụ kiện bằng thép không gỉ.

8.1.4.3  Mặt trên của khung ở cả hai mặt của buồng môi trường theo chiều dài buồng có các rãnh hình chữ U được cắt vào mặt trên để giữ các thanh cố định và vuông góc với các mặt của buồng. Các đoạn cong hình chữ U được cắt đến độ sâu tối đa là 0,6 cm và rộng 1,1 cm.

8.1.4.4  Các thanh có chiều dài 57 cm và đường kính 1,2 cm. Có thể dễ dàng điều chỉnh mười thanh chứa từ 10 đến 15 mẫu da phèn xanh và da phèn trắng được treo vuông góc với thanh trong buồng môi trường. Để thay thế thanh treo các mẫu thử, có thể sử dụng một sợi dây xuyên qua phần trên cùng của buồng môi trường.

8.1.4.5  Dây đồng cứng bọc nhựa cách điện cỡ 14 (đường kính 3 mm) rất hữu ích trong việc làm móc treo cho các mẫu da phèn xanh và da phèn trắng. Dây có thể uốn cong thành hình chữ “S” phù hợp để treo mẫu thử và giữ nguyên hình dạng của mẫu cho nhiều mục đích sử dụng.

8.1.5  Mặt trên của buồng môi trường được làm bằng chất dẻo acrylic và được thiết kế để có các mặt thẳng và chóp dốc để hơi ẩm sẽ ngưng tụ xuống các mặt và được tuần hoàn ngược trở lại thay vì nhỏ giọt lên các mẫu da phèn xanh và da phèn trắng. Mặt trên có tay cằm ở phía trước, bản lề ở phía sau và thanh chống hỗ trợ ở mỗi bên để cho phép nắp đậy được cố định ở vị trí mở. Các kích thước điển hình bao gồm:

8.1.5.1  Các thành bên: hai tấm acrylic được cắt kích thước mặt đáy 99 cm × 6 cm và tạo góc 40 độ đối với mỗi mặt là 64 cm tạo thành đỉnh.

8.1.5.2  Mặt trước và Mặt sau: tấm đáy rộng 69 cm × 6 cm và gắn vào một tấm nghiêng một góc 40 độ, kích thước 69 cm × 64 cm (chiều rộng × chiều dài).

8.1.5.3  Tay cầm được gắn trên mặt trước của tấm. Phần đế của tay cầm có kích thước 3 cm × 3 cm × 30 cm (chiều dày × chiều rộng × Chiều dài) và dùng để gắn tay cầm (kích thước 30 cm × 5 cm × 1 cm (chiều dài × chiều rộng × chiều dày).

8.1.5.4  Các thanh chống đơn hoặc đôi được sử dụng và có kích thước 69 cm × 7 cm × 1 cm (chiều dài × chiều rộng × chiều dày).

Hình 5 - Buồng môi trường với các thanh treo

8.2  Buồng môi trường phải có khả năng duy trì được độ ẩm tương đối từ 95 % đến 98% ở nhiệt độ khoảng 32 °C (90 °F) trong khi vẫn có thể cấy liên tục các bào tử nấm lên bề mặt mẫu thử.

8.2.1  Phải duy trì nhiệt độ phòng trong khoảng 24 °C sao cho tổn thất nhiệt từ tủ là không đáng kể và có thể đạt độ ẩm tương đối từ 95 % đến 98% dễ dàng trong buồng môi trường. Ngoài ra, tủ phải được cách nhiệt bằng vật liệu thích hợp để giảm thiểu thất thoát nhiệt.

8.2.2  Bộ gia nhiệt nước bằng điện được lắp đặt ở đáy buồng với các kết nối kín nước ở cuối thành. Xem Hình 6 đến Hình 8.

8.2.3  Bộ gia nhiệt phải có kích thước phù hợp để có thời gian hồi phục hợp lý và làm nóng nước đồng đều khi buồng được đóng mở để đặt hoặc kiểm tra mẫu. Mẫu được đặt ngâm ngập sao cho khi có 8 cm đến 17 cm nước ở đáy buồng tùy thuộc vào vị trí của bộ gia nhiệt.

8.2.4  Nhiệt độ trong buồng môi trường phải được theo dõi và kiểm soát bằng cách đặt một cặp nhiệt thích hợp hoặc RTD ở vị trí gần các mẫu thử.

8.2.5  Nhiệt độ có thể được hiển thị và điều khiển bằng bộ điều khiển tỷ lệ ở trạng thái rắn. Xem Hình. 9 và Hình 10.

8.2.6  Hệ thống nước chảy qua bao gồm một van điện từ 120 VAC bằng đồng thau có bộ hẹn giờ, ống cấp nước và ống xả tràn được sử dụng để ngăn chặn tình trạng vô tình làm đầy nước vào bồn chứa. Hệ thống này bổ sung nước vào bể hàng ngày với lượng nước dư chảy vào ống thoát nước có kết nối với cống thoát nước. Xem Hình 11 và Hình 12. Đối với các phòng không có ống thoát nước, phải sử dụng van phao để bật và tắt nước.

8.2.7  Sử dụng quạt để luân chuyển nhẹ nhàng không khí trong buồng môi trường nhằm hỗ trợ phân tán bào tử.

9  Thuốc thử và vật liệu

9.1  Đất

9.1.1  Với mục đích duy trì độ ẩm cao trong lớp đất và là môi trường cho sự phát triển ban đầu của vi nấm cho buồng môi trường, phải sử dụng đất đã được khử trùng thương mại chất lượng tốt do có nguy cơ liên quan đến các mầm bệnh truyền qua đất. Đất phải chứa ít nhất 25% rêu than bùn hoặc các chất hữu cơ thích hợp khác và có độ pH từ 5,5 - 7,6. Thêm một phần khoáng chất hoặc đá trân châu vào ba phần đất, nếu đất trồng trong chậu thương mại không chứa khoáng chất hoặc đá trân châu (perlite).

9.2  Sử dụng thạch dextrose khoai tây để nuôi cấy nấm từ một trong các nguồn sau:

9.2.1  Bột thạch dextrose khoai tây (có bán trên thị trường).

9.2.2  Đĩa thạch dextrose khoai tây (có bán trên thị trường).

9.2.3  Cách làm thạch dextrose khoai tây như sau:

9.2.3.1  Đun sôi 300 g khoai tây cắt hạt lựu trong 500 mL nước cho đến khi chín kỹ. Lọc khoai tây đã nấu chín qua vải thưa và thêm nước vào dung dịch lọc để tạo thành 1,0 L.

9.2.3.2  Thêm 15 g thạch vào dung dịch lọc và hòa tan bằng cách đun hỗn hợp đến sỏi trong khi khuấy liên tục. Thêm 20g glucose vào hỗn hợp.

9.2.3.3  Chia hỗn hợp vào các bình thích hợp và khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 °C tại áp suất 15 psi trong 20 min. Lấy ra khỏi nồi hấp và đổ vào đĩa petri. Để nguội và để đông cứng ở nhiệt độ phòng.

9.2.3.4  Nếu không cần dùng ngay, phải cất vào tủ lạnh.

9.3  Chất cấy, các yếu tố liên quan đến việc xử lý nấm, bao gồm thu thập, nuôi cấy và cấy vào đất trong buồng môi trường.

9.3.1  Chất cấy đáp ứng các yêu cầu của phương pháp này có sẵn trên thị trường là ATCC (American Type Culture Collection) 16404, và từ một số nguồn cung cấp cho phòng thí nghiệm.

9.3.2  Lấy các mẫu da phèn xanh hoặc da phèn trắng có nấm phát triển từ cơ sở thuộc da để nuôi cấy và sử dụng để cấy vào đất trong buồng môi trường. Việc thành công trong thu thập nấm phát triển trên da phèn xanh hoặc da phèn trắng phụ thuộc vào việc lựa chọn thích hợp da phèn xanh hoặc da phèn trắng với sự phát triển của nấm hoạt động và nhanh chóng đưa đến phòng thí nghiệm để sử dụng trong buồng môi trường.

9.3.3  Tiến hành cấy và cấy truyền nấm trên bề mặt đã khử trùng trong phòng càng sạch càng tốt. Lý tưởng nhất là sử dụng tủ hút mùi cho công việc nuôi cấy nếu có.

9.3.4  Sử dụng tăm bông vô trùng hoặc thiết bị cấy thích hợp khác để chuyển nấm từ da phèn xanh hoặc da phèn trắng sang đĩa PDA hoặc từ đĩa này sang đĩa khác.

9.3.5  Ủ các đĩa đã cấy ở nhiệt độ phòng cho đến khi nấm phát triển bao phủ bề mặt thạch, hoặc trong tủ ấm ở nhiệt độ ấm thích hợp (từ 30 °C đến 32 °C).

10  Lấy mẫu, mẫu thử và đơn vị thử nghiệm

Đặt mẫu da phèn xanh hoặc da phèn trắng trên một thớt sạch. Sử dụng dao mổ có lưỡi cắt không gỉ, cắt một mẫu thử hình chữ nhật có kích thước phù hợp (kích thước điển hình 5 cm × 10 cm). Nếu sử dụng mẫu thử có kích thước khác, phải ghi trong báo cáo thử nghiệm.

11  Cách tiến hành

11.1  Đổ đất vào khay với độ sâu khoảng 6 cm và để có kết quả tốt nhất, tránh nén chặt đất.

11.2  Phủ nhẹ lên bề mặt đất bột thạch dextrose khoai tây và nhẹ nhàng trộn trên bề mặt.

11.3  Cắt phần thạch đã cấy và trộn vào đất trong khay. Có thể dùng cách khác như sau, trước hết trộn thạch đã tách vào bột PDA và sau đó đặt lên trên lớp đất.

11.4  Ủ đất đã cấy trong khay trong hai tuần tại điều kiện nhiệt độ thích hợp (32,5 ± 1) °C và môi trường ẩm (độ ẩm tương đối từ 95 % đến 98%). Thông thường, sự phát triển của nấm trong đất được cấy giảm đáng kể sau hai tuần ủ.

11.5  Trong khoảng thời gian hai tuần này, bắt đầu thêm các miếng da phèn xanh (hoặc da phèn trắng) chưa xử lý hoặc các miếng da phèn xanh (hoặc da phèn trắng) có sự phát triển của nấm từ các thử nghiệm trước đó vào các thanh trong buồng môi trường. Kể từ thời điểm này, phải giữ các mẫu da phèn xanh và da phèn trắng có nấm phát triển treo trong buồng để liên tục cung cấp bào tử cho việc cấy các mẫu thử nghiệm. Để đưa một loài nấm mới vào buồng, phải thử nuôi loài nấm mong muốn trên một mẫu da phèn xanh hoặc da phèn trắng chưa qua xử lý trong đĩa Petri và sau đó chuyển mẫu vào buồng môi trường.

11.6  Khi buồng đã được cấy tốt, bắt đầu tiến hành thử.

11.7  Rạch một đường thẳng đứng gần đầu của mẫu thử đủ rộng để chèn một móc treo tráng phủ hoặc móc thép không gỉ và sử dụng dao mổ để khắc chữ số La Mã gần đáy của mẫu thử trên mặt thớt để xác định số mẫu. Ví dụ: đối với mẫu số một, khắc chữ “I”. có thể dán nhãn cho ít nhất một mẫu để nhận dạng mẫu (thường là mẫu đầu tiên trong dãy mẫu) bằng loại dây buộc nhựa bao gồm một vùng nhãn. Ghi nhãn dây bao gồm toàn bộ hoặc một phần số lô hoặc số nhận dạng khác cộng với số mẫu, ví dụ 9265-1.

11.7.1  Phương pháp thay thế để chuẩn bị mẫu thử là sử dụng dụng cụ đục lỗ da hoặc búa và đục thay cho sử dụng dao mổ để xuyên qua mẫu để treo.

11.8  Đặt (các) mẫu thử vào một túi poly có dán nhãn, có thể kéo lại được, và đưa vào buồng môi trường. Mở nắp của buồng và tháo một thanh treo. Nếu thanh treo không dán nhãn, phải cung cấp số nhận dạng hoặc chữ cái, sau đó treo các mẫu thử lên thanh. Cứ sau ba đến năm mẫu thử có da phèn xanh hoặc da phèn trắng trên giá đỡ cho thấy diện tích sạch nhỏ hơn hoặc bằng 50% để dùng làm chất cấy. Đưa que trở lại khoang và đóng chặt nắp khoang để tránh mất độ ẩm trong quá trình bảo quản mẫu thử.

12  Quy trình đánh giá

12.1  Kiểm tra mẫu thử bảy ngày một lần để tìm sự phát triển của nấm trong khoảng thời gian 28 ngày. Ghi lại lượng nấm phát triển trên mỗi mặt của mẫu thử da phèn xanh, da mộc crom hoặc da phèn trắng. Đánh giá sự phát triển của nấm bằng cách sử dụng biểu đồ sau:

13  Độ chụm và độ chệch

13.1  Độ chụm của phương pháp thử này dựa trên nghiên cứu liên phòng thí nghiệm WK18553, Phương pháp thử chuẩn khả năng kháng lại sự phát triển của nấm trên bề mặt da phèn xanh trong buồng môi trường, được tiến hành vào năm 2008. Mỗi phòng thí nghiệm trong số mười phòng thí nghiệm đã thử nghiệm các mặt thịt và mặt cật của ba mẫu vật liệu riêng biệt (được xác định là “A”, “B” và “C”) về tổng khả năng kháng sự phát triển của nấm trong chín tuần. Mỗi “kết quả thử” đại diện cho một quyết định riêng của kỹ thuật viên phòng thí nghiệm. Mỗi phòng thí nghiệm được yêu cầu báo cáo kết quả thử nghiệm ba lần (từ một người điều hành) cho mỗi vật liệu. Thực hiện theo ASTM E691 để thiết kế và phân tích dữ liệu[3].

13.1.1  Giới hạn lặp lại (r): Hai kết quả thử nghiệm thu được trong một phòng thí nghiệm sẽ được đánh giá là không tương đương nếu chúng khác vượt quá giá trị “r” đối với vật liệu đó; “r” là khoảng thể hiện sự khác biệt tới hạn giữa hai kết quả thử nghiệm đối với cùng một loại vật liệu, thu được bởi cùng một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị vào cùng một ngày trong cùng một phòng thí nghiệm.

13.1.1.1  Giới hạn lặp lại được liệt kê trong Bảng 1 đến Bảng 9.

13.1.2  Giới hạn tái lập (R): Hai kết quả thử nghiệm sẽ được đánh giá là không tương đương nếu chúng khác nhau vượt quá giá trị “R” đối với vật liệu đó; “R” là khoảng thể hiện sự khác biệt tới hạn giữa hai kết thử nghiệm đối với cùng một loại vật liệu, thu được bởi những người thực hiện khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau trong các phòng thí nghiệm khác nhau.

13.1.2.1  Giới hạn tái lập được liệt kê trong Bảng 1 đến Bảng 9.

13.1.3  Các thuật ngữ trên (giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập) tuân theo ASTM E177.

13.1.4  Bất kỳ đánh giá nào theo 13.1.1 và 13.1.2 sẽ có xác suất đúng khoảng 95 %.

13.2  Độ chệch: tại thời điểm nghiên cứu, không có tài liệu tham khảo được chấp nhận phù hợp để xác định độ chệch cho phương pháp thử nghiệm này, do đó không có tuyên bố nào về độ chệch.

13.3  Tuyên bố về độ chụm được xác định thông qua kiểm tra thống kê 512 kết quả, từ mười phòng thí nghiệm, trên ba vật liệu. Ba tài liệu này đã được xác định như sau:

13.3.1  Vật liệu A: da phèn xanh được xử lý bằng thuốc diệt nấm nồng độ thấp.

13.3.2  Vật liệu B: da phèn xanh được xử lý bằng thuốc diệt nấm ở nồng độ trung bình.

13.3.3  Vật liệu C: da phèn xanh được xử lý bằng thuốc diệt nấm nồng độ cao.

13.4  Để đánh giá sự tương đương của hai kết quả thử nghiệm, phải chọn vật liệu có đặc điểm giống vật liệu thử nghiệm nhất.

Bảng 1 -Tuần 1

Bảng 3-Tuần 3

Bảng 4 - Tuần 4

Bảng 5 - Tuần 5

Bảng 6 - Tuần 6

Bảng 7 - Tuần 7

Bảng 8 - Tuần 8

Bảng 9 - Tuần 9