\r\n\r\n
TIÊU CHUẨN\r\nNGÀNH
\r\n\r\n
10 TCN\r\n815:2006
\r\n\r\n
QUY\r\nTRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ VỊT
\r\n\r\n
Protocol for duck\r\nvirus enteritis diagnosis
\r\n\r\n
1. Phạm\r\nvi áp dụng:
\r\n\r\n
Quy trình\r\nnày được áp dụng để chẩn đoán bệnh Dịch tả vịt tại các phòng thí\r\nnghiệm chẩn đoán bệnh động vật.
\r\n\r\n
2.\r\nKhái niệm
\r\n\r\n
- Bệnh Dịch tả\r\nvịt (Duck Virus Enteritis ) là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm\r\nxảy ra ở vịt, ngan, ngỗng các lứa tuổi.
\r\n\r\n
- Nguyên\r\nnhân gây bệnh do herpes virus.
\r\n\r\n
3.\r\nLấy mẫu:
\r\n\r\n
3.1. Lấy\r\nmẫu:
\r\n\r\n
Mẫu bệnh\r\nphẩm lấy từ vịt nghi mắc bệnh là:
\r\n\r\n
- Gan,\r\nlách, thận (đối với vịt chết lấy mẫu trong vòng 24h).
\r\n\r\n
- Huyết\r\nthanh.
\r\n\r\n
3.2. Bảo\r\nquản và gửi mẫu bệnh phẩm
\r\n\r\n
- Mẫu\r\nđược lấy ngay sau khi mổ khám.
\r\n\r\n
- Mẫu\r\nđược lấy vào lọ hoặc túi nylon sạch.
\r\n\r\n
- Dán\r\nnhãn.
\r\n\r\n
- Bảo\r\nquản mẫu ở nhiệt độ 4-8oC.
\r\n\r\n
- Có\r\nphiếu gửi bệnh phẩm.
\r\n\r\n
4.\r\nMáy móc - Dụng cụ - Hoá chất - Nguyên liệu
\r\n\r\n
4.1. Máy\r\nmóć:
\r\n\r\n
- Tủ\r\nlạnh âḿ: -15 đến -20oC.
\r\n\r\n
- Tủ\r\nlạnh thường: +2 đến +8oC.
\r\n\r\n
- Tủ ấm.
\r\n\r\n
- Tủ ấm CO2.
\r\n\r\n
- Máy lắc đĩa\r\n(orbital shaker).
\r\n\r\n
- Máy\r\nlắc trộn (vortex mixer).
\r\n\r\n
- Máy\r\nkhuấy từ.
\r\n\r\n
- Nồi đun\r\ncách thuỷ (water bath).
\r\n\r\n
- Buồng cấy BSC\r\n(Bio-safety cabinet).
\r\n\r\n
- Máy ly tâm.
\r\n\r\n
- Máy hút chân\r\nkhông.
\r\n\r\n
- Đèn soi trứng.
\r\n\r\n
- Tủ ấp trứng.
\r\n\r\n
4.2. Dụng cụ:
\r\n\r\n
- Bình tam giác\r\ncác cỡ: 100, 200, 500 và 1000 ml.
\r\n\r\n
- ống đong thuỷ\r\ntinh các cỡ: 50, 100, 200, 500 và 1000 ml.
\r\n\r\n
- Cốc có mỏ các\r\ncỡ: 100, 200, 500 và 1000 ml.
\r\n\r\n
- ống nghiệm.
\r\n\r\n
- Lọ nhỏ chắt\r\nhuyết thanh.
\r\n\r\n
- Pipet thuỷ tinh:\r\n1, 5 và 10 ml.
\r\n\r\n
- Micropipet đơn:\r\n0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 ml.
\r\n\r\n
- Micropipet nhiều\r\nđầu (8-12): 5-50, 50-300 ml.
\r\n\r\n
- Cối chày sứ.
\r\n\r\n
- Khăn bông.
\r\n\r\n
- Dao, kéo, panh\r\nkẹp.
\r\n\r\n
- Khuấy từ.
\r\n\r\n
- Dụng cụ nuôi cấy\r\ntế bào: lọ nhựa T25, đĩa nhựa 96 lỗ, đĩa nuôi cấy 6 lỗ, 24 lỗ.
\r\n\r\n
- Màng lọc Millipor\r\n0,45mm.
\r\n\r\n
- Đĩa petri.
\r\n\r\n
4.3. Hoá chất (hóa chất phân tích\r\ntinh khiết dành cho phòng thí nghiệm)
\r\n\r\n
- Nước cất hoặc\r\nnước khử ion.
\r\n\r\n
- NaCl.
\r\n\r\n
- KCl.
\r\n\r\n
- Na2HPO4.
\r\n\r\n
- KH2PO4.
\r\n\r\n
- NaHCO3
\r\n\r\n
-\r\nChloroform.
\r\n\r\n
- Tris/HCl
\r\n\r\n
- EDTA
\r\n\r\n
- Hoá\r\nchất để tiêu độc, tiệt trùng: Formalin, Chloramin.
\r\n\r\n
4.4.\r\nNguyên liệu:
\r\n\r\n
- Môi\r\ntrường nuôi cấy tế bào:
\r\n\r\n
+ L-glutamine
\r\n\r\n
+ TPB – Tryptose Photphat Broth
\r\n\r\n
+ Trypsine
\r\n\r\n
+ Eagle’s minimum\r\nessential medium (MEM)
\r\n\r\n
+ Tryptose Photphat Broth (TPB)
\r\n\r\n
+ Fetal calf serum (FCS).
\r\n\r\n
- Kháng sinh:\r\nPenicillin, Streptomycin, Kanamycin.
\r\n\r\n
- Vịt con 1-7 ngày\r\ntuổi.
\r\n\r\n
- Trứng vịt có\r\nphôi (11-12 ngày tuổi).
\r\n\r\n
- Trứng vịt có\r\nphôi (9-10 ngày tuổi): dùng để làm tế bào xơ phôi vịt (DEF – Duck\r\nEmbryo Fibroblast).
\r\n\r\n
- Giống virus Dịch\r\ntả vịt.
\r\n\r\n
- Kháng huyết thanh\r\nDịch tả vịt.
\r\n\r\n
![]()
\r\n\r\n
5.1. Kiểm tra một số đặc điểm dịch tễ\r\nhọc – triệu chứng:́́
\r\n\r\n
- Tìm hiểu bệnh sử\r\nvà truyền lây của bệnh như:
\r\n\r\n
+ Bệnh xảy ra ở\r\nvịt, ngan, ngỗng mọi lứa tuổi.
\r\n\r\n
+ Bệnh lây lan nhanh\r\nvà trầm trọng trong khoảng 2-3 ngày.
\r\n\r\n
- Kiểm tra triệu\r\nchứng:
\r\n\r\n
+ Giảm ăn, mất\r\nthăng bằng, ỉa phân loãng, xù lông.
\r\n\r\n
+ Mắt có dử, mí\r\nmắt sưng, sợ ánh sáng, chảy nước mũi.
\r\n\r\n
5.2 Kiểm tra bệnh\r\ntích:
\r\n\r\n
- Kiểm tra bệnh\r\ntích đại thể:\r\n
\r\n\r\n
+ Ở vịt trưởng\r\nthành có hiện tượng gan bị bạc màu. ở con đực trưởng thành có thể\r\nxảy ra hiện tượng dương vật bị thay đổi vị trí, ở con cái quan sát\r\nthấy các nang trứng bị xuất huyết.
\r\n\r\n
+ Mạch máu bị tổn\r\nthương, tổn thương hệ bạch huyết, thoái hoá nhu mô. ống tiêu hoá có\r\nnhiều chất nhờn. Đây là đặc trưng của bệnh Dịch tả vịt.
\r\n\r\n
- Kiểm tra\r\nbệnh tích vi thể:
\r\n\r\n
+ Tổn thương\r\nmạch máu và các cơ quan phủ tạng. Xuất hiện các thể vùi nội nhân,\r\nthể vùi tế bào chất trong các tế bào biểu mô của hệ thống tiêu\r\nhoá. Đây là bệnh tích đặc trưng của bệnh.
\r\n\r\n
5.3. Chẩn\r\nđoán phòng thí nghiệm
\r\n\r\n
5.3.1. Phát\r\nhiện virus:
\r\n\r\n
Xử lý bệnh\r\nphẩm:
\r\n\r\n
- Mẫu gan,\r\nlách, thận được xử lý thành huyễn dịch 10% với PBS có chứa 200\r\nUI/ml Penicillin và 200mg/ml\r\nStreptomycin.
\r\n\r\n
- Ly tâm\r\n2.000 vòng/15ph.
\r\n\r\n
- Lấy dịch\r\ntrong ở trên.
\r\n\r\n
- Kiểm tra\r\nvô trùng: trên môi trường nước thịt BHI, hoặc môi trường thạch máu.
\r\n\r\n
5.3.1.1. Phân\r\nlập virus:
\r\n\r\n
a. Phân lập\r\ntrên trứng vịt có phôi:
\r\n\r\n
- Tiêm 0,2ml\r\nhuyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý vào xoang niệu mô hoặc màng CAM phôi\r\nvịt 11-12ngày: 5 phôi/mẫu bệnh phẩm.
\r\n\r\n
- Trứng\r\nđược ấp tiếp ở tủ ấp 37oC.
\r\n\r\n
- Soi trứng. Loại\r\nbỏ những phôi chết trong khoảng 24h sau khi tiêm.
\r\n\r\n
- Virus DTV gây chết\r\nphôi sau 4-10 ngày với đặc trưng: Xuất huyết lan rộng.
\r\n\r\n
- Thu hoạch gan phôi\r\nvà nước niệu để giám định virus.
\r\n\r\n
b. Phân lập trên tế\r\nbào xơ phôi vịt (Duck Embryo Fibroblast – DEF):
\r\n\r\n
- Cấy tế bào DEF\r\ntrên các lọ nuôi cấy T25 hoặc đĩa nuôi cấy ( đĩa nuôi cấy 6 lỗ, 24\r\nlỗ), sau 2-3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70%) thì gây nhiễm\r\nhuyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý: 500µl/lỗ hoặc lọ. Việc cấy chuyển 2\r\nlần là cần thiết trong qúa trình phân lập.
\r\n\r\n
- Quan sát bệnh\r\ntích tế bào (CPE-Cytopathic pathogene effect): đặc trưng với đám tế bào\r\nto, tròn và trở nên hoại tử sau 2-4 ngày sau đó.
\r\n\r\n
- Thu hoạch hỗn\r\ndịch tế bào, đông tan, ly tâm và thu phần nước trong cho giám định\r\nvirus.
\r\n\r\n
5.3.1.2. Phương pháp\r\ngiám định virus
\r\n\r\n
a. Phương pháp trung\r\nhoà trên trứng vịt có phôi (VN - Virus Nertralization):
\r\n\r\n
(phôi vịt 10-14 ngày\r\ntuổi).
\r\n\r\n
- Chuẩn bị:
\r\n\r\n
+ Pha loãng virus\r\nphân lập: Nồng độ 10-1–10-9 với dung dịch PBS.
\r\n\r\n
+ Lô đối chứng (+):\r\nTrộn kháng huyết thanh dương tính DTV với các nồng độ virus đã pha\r\nloãng theo tỷ lệ 1:1.
\r\n\r\n
+ Lô đối chứng (-):\r\nTrộn huyết thanh (-) tính với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ\r\nlệ 1:1.
\r\n\r\n
+ Ủ hỗn hợp trên ở\r\nnhiệt độ 37oC/1h.
\r\n\r\n
- Tiến hành:
\r\n\r\n
+ Tiêm hỗn hợp trên vào xoang niệu mô\r\nphôi trứng (0,2ml/phôi), 5 phôi/nồng độ.
\r\n\r\n
+ Phôi được ấp tiếp ở tủ ấp 37oC\r\ntrong 10 ngày. Loại bỏ những phôi chết trước 24h.
\r\n\r\n
+ Phôi chết xảy ra trong 4-10 ngày, có\r\nbệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.
\r\n\r\n
- Đánh giá kết\r\nquả:
\r\n\r\n
Tính toán chỉ số\r\ntrung hoà NI (neutralization index).
\r\n\r\n
b. Phương pháp trung\r\nhoà trên tế bào xơ phôi vịt (DEF):
\r\n\r\n
- Chuẩn bị:
\r\n\r\n
+ Tế bào DEF trên\r\nđĩa nuôi cấy tế bào 96 lỗ đã nuôi cấy được 2-3 ngày.
\r\n\r\n
+ Pha loãng virus\r\nphân lập: các nồng độ 10-1–10-9 với môi trường\r\nnuôi cấy MEM.
\r\n\r\n
+ Lô đối chứng (+):\r\ntrộn kháng huyết thanh dương tính DTV với các nồng độ virus đã pha\r\nloãng theo tỷ lệ 1:1.
\r\n\r\n
+ Lô đối chứng (-):\r\ntrộn huyết thanh (-) tính với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ\r\nlệ 1:1.
\r\n\r\n
- Tiến\r\nhành:
\r\n\r\n
+ Gây\r\nnhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đã nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 lỗ),\r\n100µl/lỗ, 8 lỗ/nồng độ.
\r\n\r\n
+ Ủ đĩa\r\nnuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 37oC/1h.
\r\n\r\n
+ Đổ bỏ\r\nhỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100µl/lỗ.
\r\n\r\n
+ Tiếp\r\ntục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 37oC.
\r\n\r\n
+ Kiểm\r\ntra bệnh lý tế bào (CPE) trong 3-7 ngày với biểu hiện tế bào to tròn\r\nvà tụ lại thành từng đám, thời gian lâu có hiện tượng tế bào bi\r\nhoại tử.
\r\n\r\n
- Đánh\r\ngiá kết quả:
\r\n\r\n
+ Tính\r\ntoán chỉ số trung hoà NI (neutralization index).
\r\n\r\n
5.3.1.3.\r\nPhát hiện virus Dịch tả vịt bằng phương pháp PCR:
\r\n\r\n
PCR có thể dùng để\r\nphát hiện virus DTV trong các tổ chức như: Thực quản, gan và lách hoặc sau khi\r\ntiến hành phân lập trên phôi vịt.
\r\n\r\n
a. Chiết tách DNA virus:
\r\n\r\n
DNA có thể chiết tách từ dịch tế bào phân lập\r\nvirus, huyễn dịch bệnh phẩm 10% hoặc dịch ngoáy ổ nhớp.
\r\n\r\n
- Bước 1: Đối với huyễn dịch bệnh phẩm 10%:\r\nNhỏ 400 µl vào ống 1.5ml và ly tâm ở 16000 g trong 5 phút. Hút dịch nổi sang\r\nống mới và bắt đầu bước 2
\r\n\r\n
- Bước 2: Đối với dịch tế bào và dịch ngoáy ổ\r\nnhớp: Nhỏ 400 µl mẫu hoặc dịch nổi từ bước trên vào ống 1.5 ml và ly tâm ở\r\n16000 – 20000 g trong 45 phút để lắng virus
\r\n\r\n
- Bước 3: Đổ bỏ dịch nổi và hòa tan cặn lắng\r\nbằng 200 µl dung dịch Tris/EDTA (10 mM Tris/HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)
\r\n\r\n
- Bước 4: Thêm 10 µl dung dịch proteinase K 5\r\nµg/µl để đạt nồng độ cuối là 0,2 µg/µl, trộn đều và ủ ở 56oC trong 1\r\ngiờ
\r\n\r\n
- Bước 5: Thêm 25 µl dung dịch SDS 10% để\r\nnồng độ cuối là 1%, trộn đều và ủ ở 37oC trong 1 giờ.
\r\n\r\n
- Bước 6: Thêm 15 µl NaCl 5M để đạt nồng độ\r\ncuối cùng là 0,3 M và trộn đều
\r\n\r\n
- Bước 7: Thêm 300 µl dung dịch phenol đệm\r\nvới Tris/HCl, pH 8,0 và trộn đều (có thể bằng cách đảo lộn ống 50 lần)
\r\n\r\n
- Bước 8: Ly tâm ống ở 16000 g trong 5 phút\r\nvà chuyển pha nước nổi sang ống mới
\r\n\r\n
- Bước 9: Lặp lại bước 7 và 8 thêm lần nữa
\r\n\r\n
- Bước 10: Thêm 500 µl ether trộn đều, và ly\r\ntâm ở 16000 g trong 1 phút
\r\n\r\n
- Bước 11: Hút bỏ pha nước, và lặp lại bước\r\n10 1 lần nước
\r\n\r\n
- Bước 12: mở nắp ống và để ở nhiệt độ 56oC\r\ntrong 15 phút hoặc đến khi ngửi thấy hết mùi ether
\r\n\r\n
- Bước 13: Chia lượng mẫu trong ống làm 2, và\r\nthêm lượng cồn tuyệt đối gấp 2,25 lần lượng mẫu và trộn đều, để ở nhiệt độ\r\nphòng (22oC) trong 30 phút
\r\n\r\n
- Bước 14: Ly tâm ở 16000 g trong 45 phút và\r\nbỏ nước nổi
\r\n\r\n
- Bước 15:Thêm 200 µl cồn 70% hòa tan nhẹ\r\nnhàng cặn lắng và lại ly tâm ở 16000 g trong 15 phút
\r\n\r\n
- Bước 16: Bỏ dịch nổi và làm khô cặn lắng ở\r\n56oC trong 30-45 phút
\r\n\r\n
- Bước 17: Hòa tan DNA bằng 30 µl nước cất\r\nRNAse vàDNAse free.
\r\n\r\n
- Có thể để mẫu ở 4oC trong vài\r\nngày hoặc ở -20oC nều muốn bảo quản lâu
\r\n\r\n
b. Chạy PCR
\r\n\r\n
Khi pha các hỗn hợp phản ứng nên theo hướng\r\ndẫn của nhà sản xuất đối với phản ứng hot start PCR
\r\n\r\n
Trình tự cặp mồi (primer) dùng để phát\r\nhiện virus Dịch tả vịt
\r\n\r\n
\r\n \r\n | \r\n Primer\r\n 1 \r\n | \r\n \r\n 5'-GAA-GGC-GGG-TAT-GTA-ATG-TA-3'\r\n (tiến) \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Primer\r\n 2 \r\n | \r\n \r\n 5'-CAA-GGC-TCT-ATT-CGG-TAA-TG-3'\r\n (lùi) \r\n | \r\n
\r\n
\r\n\r\n
Chu trình nhân gien
\r\n\r\n
\r\n \r\n | \r\n 1 vòng \r\n | \r\n \r\n 94°C -\r\n 2 phút \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 37°C -\r\n 1 phút \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n 35\r\n vòng \r\n | \r\n \r\n 94°C -\r\n 1 phút \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 55°C -\r\n 1 phút \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 72°C - 3 phút \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n 1 vòng \r\n | \r\n \r\n 72°C\r\n for 7 phút \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Giữ ở 4oC đến khi\r\n chạy điện di \r\n | \r\n
\r\n
\r\n\r\n
Chạy điện di sản phẩm PCR
\r\n\r\n
- Pha thạch Agar 1% bằng dung dịch đệm TAE,\r\nđun cho tan đều, khi đã nguội, đổ vào khuôn điện di (có lược)
\r\n\r\n
- Khi thạch đã đông, để vào trong buồng điện\r\ndi có đệm TAE
\r\n\r\n
- Các sản phẩm PCR được pha với dung dịch\r\nloading với tỷ lệ 1/10 và nhỏ vào các giếng trên miếng thạch Agar (10 µl/mẫu)
\r\n\r\n
- Chạy điện di trong 1 giờ ở nhiệt độ 120 v,\r\nsau đó nhuôm thạch với ethidium bromide trong 20 phút. Rửa bỏ thuốc nhuộm bằng\r\ncách ngâm trong nước cất 45 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV, chụp ảnh.
\r\n\r\n
c. Đọc kết quả:
\r\n\r\n
- Mẫu đối chứng dương và các mẫu dương tính\r\ncó vạch với kích cỡ 446 bp
\r\n\r\n
- Mẫu đối chứng âm và các mẫu âm tính không\r\ncó vạch.
\r\n\r\n
5.3.2. Phát hiện\r\nkháng thể:
\r\n\r\n
Sử dụng phương\r\npháp trung hoà (SN – Serum Nertralization) để phát hiện kháng thể:\r\nPhương pháp này được thực hiện trên trứng vịt có phôi, hoặc trên tế\r\nbào DEF
\r\n\r\n
Mẫu: là huyết\r\nthanh vịt nghi mắc bệnh.
\r\n\r\n
5.3.2.1. Trên trứng\r\nvịt có phôi:\r\n10-14 ngày tuổi.
\r\n\r\n
- Chuẩn bị:
\r\n\r\n
+ Xử lý mẫu huyết\r\nthanh ở 56oC /30p.
\r\n\r\n
+ Pha loãng mẫu\r\nhuyết thanh theo cơ số 2 ở 10 nồng độ (1/5, 1/10,...1/2560).
\r\n\r\n
+ Pha loãng virus\r\nDTV liều 100 EID50.
\r\n\r\n
- Tiến hành:
\r\n\r\n
+ Trộn virus DTV và\r\nhuyết thanh kiểm tra đã chuẩn bị ở trên theo tỷ lệ 1:1
\r\n\r\n
+ Ủ hỗn hợp kháng\r\nnguyên – kháng thể ở tủ ấm 37oC/1h .
\r\n\r\n
+ Tiêm hỗn hợp trên\r\nvào xoang niệu mô phôi trứng (0,2ml/phôi), 5 phôi/nồng độ.
\r\n\r\n
+ Trứng được ấp\r\ntiếp ở 37oC trong 14 ngày.
\r\n\r\n
+ Soi trứng. Loại\r\nbỏ những phôi chết trước 24h.
\r\n\r\n
- Đánh giá kết\r\nquả:
\r\n\r\n
+ Phôi chết xảy ra\r\ntrong 4-10 ngày với bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.
\r\n\r\n
+ Tính toán chỉ\r\nsố trung hoà NI và hiệu giá trung hoà theo công thức của Reed và\r\nMuench
\r\n\r\n
5.3.2.2. Trên tế\r\nbào xơ phôi vịt DEF:
\r\n\r\n
- Chuẩn bị:
\r\n\r\n
+ Làm và pha loãng\r\ntế bào DEF với số lượng cần thiết (4x105 tế bào/ml).
\r\n\r\n
+ Xử lý mẫu huyết\r\nthanh ở 56oC /30p.
\r\n\r\n
+ Pha loãng virus\r\nDTV chuẩn liều 100 TCID50(50% Tissue culture infective dose).
\r\n\r\n
- Tiến hành: Trên\r\nđĩa nuôi cấy 96 lỗ.
\r\n\r\n
+ Cho môi trường\r\nnuôi cấy MEM: 50µl/lỗ vào các lỗ của đĩa.
\r\n\r\n
+ Cho mẫu huyết\r\nthanh kiểm tra: 50µl vào lỗ đầu tiên, cột 1.
\r\n\r\n
+ Pha loãng mẫu\r\nhuyết thanh theo cơ số 2 (1/2, 1/4,...) từ cột 1-12.
\r\n\r\n
+ Cho virus DTV\r\nchuẩn liều 100 TCID50 : 50µl/lỗ.
\r\n\r\n
+ Ủ đĩa nuôi cấy ở\r\ntủ ấm CO2 ở 37oC/1h .
\r\n\r\n
+ Đổ bỏ hỗn hợp\r\ntrên, cho môi trường MEM (không bổ sung FCS) 100µl/lỗ.
\r\n\r\n
+ Ủ tiếp đĩa nuôi\r\ncấy ở tủ ấm CO2 ở 37oC trong 5-7 ngày.
\r\n\r\n
- Đánh giá kết\r\nquả:
\r\n\r\n
+ Kiểm tra bệnh lý\r\ntế bào (CPE) trong 3-7 ngày. Tế bào có biểu hiện to tròn và tụ lại\r\ntừng đám, thời gian lâu có hiện tượng tế bào bị hoại tử.
\r\n\r\n
+ Tính toán chỉ\r\nsố trung hoà NI và hiệu giá trung hoà theo công thức của Reed và\r\nMuench.
\r\n\r\n
6.\r\nKết luận:
\r\n\r\n
- Nếu kết quả phân\r\nlập và giám định (bằng phương pháp trung hòa VN) dương tính với kháng\r\nhuyết thanh chuẩn, kết luận có virus Dịch tả vịt.
\r\n\r\n
- Nếu kết quả PCR\r\ndương tính, kết luận dương tính virus Dịch tả vịt.
\r\n\r\n
- Nếu thủy cầm chưa\r\ntiêm phòng, phát hiện có kháng thể Dịch tả vịt (bằng phương pháp trung\r\nhòa SN), kết luận thuỷ cầm đã nhiễm virus Dịch tả vịt.
\r\n\r\n
- Nếu kết quả phân lập âm tính, PCR âm\r\ntính, kết luận âm tính virus Dịch tả vịt.
\r\n\r\n
7. Tài liệu tham khảo
\r\n\r\n
1. Manual of standards for diagnosis tests\r\nand vaccines (OIE).
\r\n\r\n
2. Manual of standards for diagnosis tests (Thailand).
\r\n\r\n
\r\n\r\n
PHỤ\r\nLỤC
\r\n\r\n
1. Công thức pha môi trường:
\r\n\r\n
• Dung dịch PBSx10:
\r\n\r\n
Thành phần:
\r\n\r\n
NaCl 80,0gr
\r\n\r\n
KCl \r\n2,0gr
\r\n\r\n
Na2HPO4 11,5gr
\r\n\r\n
KH2PO4 2,0gr
\r\n\r\n
Pha loãng với\r\n1000ml nước cất, điều chỉnh pH = 7,2.
\r\n\r\n
Hấp tiệt trùng,\r\nbảo quản ở 4oC.
\r\n\r\n
• 7% NaHCO3:
\r\n\r\n
Thành phần:
\r\n\r\n
NaHCO3 7gr
\r\n\r\n
Nước cất 100ml
\r\n\r\n
Hấp tiệt trùng và\r\nbảo quản ở 4oC.
\r\n\r\n
• 3% L-glutamine:
\r\n\r\n
Thành phần:
\r\n\r\n
L-glutamine 3\r\ngr
\r\n\r\n
Nước\r\ncất 100ml
\r\n\r\n
Lọc vô\r\ntrùng, bảo quản ở -20oC. Pha loãng virus VGV chuẩn liều 100\r\nTCID50.
\r\n\r\n
• TPB – Tryptose\r\nPhotphat Broth:
\r\n\r\n
• Thành phần:
\r\n\r\n
Tryptose Photphat 29,5gr
\r\n\r\n
Nước cất \r\n1000ml
\r\n\r\n
Hấp tiệt trùng,\r\nbảo quản ở 4oC.
\r\n\r\n
• Trypsine 2,5% (10x):
\r\n\r\n
Thành phần:
\r\n\r\n
Trypsine 2,5gr
\r\n\r\n
PBS 100ml
\r\n\r\n
Lắc qua\r\nđêm ở 4oC, lọc vô trùng và bảo quản ở -20oC.
\r\n\r\n
• Môi trường\r\nnuôi cấy tế bào MEM:
\r\n\r\n
Thành\r\nphần:
\r\n\r\n
Eagle’s\r\nminimum essential medium (MEM) 430 ml
\r\n\r\n
Tryptose Photphat\r\nBroth (TPB) 50 ml
\r\n\r\n
3% L-glutamine \r\n 5 ml
\r\n\r\n
7% NaHCO3 \r\n 5 ml
\r\n\r\n
Kháng sinh (Peni. +\r\nStrep.) 5 ml
\r\n\r\n
Fetal calf serum\r\n(FCS) 5 ml
\r\n\r\n
2. Phương pháp làm\r\ntế bào Xơ phôi vịt
\r\n\r\n
Sử dụng phôi vịt 9\r\n-10 ngày tuổi.
\r\n\r\n
1 - Mổ trứng, lấy\r\nphôi vịt.
\r\n\r\n
2 - Rửa phôi trong\r\ndung dịch PBS có chứa 1% kháng sinh.
\r\n\r\n
3 - Cắt bỏ đầu,\r\nchân, cánh và các cơ quan phủ tạng, thu hoạch gan phôi.
\r\n\r\n
4 - Rửa phôi 1-2\r\nlần trong dung dịch PBS có chứa 1% kháng sinh.
\r\n\r\n
5 - Cắt nhỏ phôi.
\r\n\r\n
6 - Tách tế bào\r\nbằng dung dịch Trypsine ấm 0,25% và lắc nhẹ 250v/p trong 15 phút.
\r\n\r\n
7 - Thu hoạch tế\r\nbào đã tách cho vào môi trường MEM + 10% huyết thanh FCS, bảo quản\r\ntrong phích đá.
\r\n\r\n
8 - Nhắc lại bước\r\n6-7.
\r\n\r\n
9 - Ly tâm huyễn\r\ndịch tế bào 1500v/p, ở 4oC trong 5 phút.
\r\n\r\n
10 - Rửa 1 lần với\r\nmôi trường nuôi cấy.
\r\n\r\n
11 - Đếm và pha\r\nloãng tế bào với môi trường phát triển (MEM + 10% FCS), lượng tế bào\r\ncần thiết tối thiểu 4x105 tế bào/ml.
\r\n\r\n
![]()
\r\n\r\n
4. Công thức tính\r\nchỉ số trung hoà NI của Reed and Muench.
\r\n\r\n
4.1. Phương pháp\r\ntrung hoà virus (VN):
\r\n\r\n
Dựa theo ví dụ\r\nsau:
\r\n\r\n
\r\n\r\n
\r\n \r\n | \r\n Virus\r\n pha loãng (log10) \r\n | \r\n \r\n -1 \r\n | \r\n \r\n -2 \r\n | \r\n \r\n -3 \r\n | \r\n \r\n -4 \r\n | \r\n \r\n -5 \r\n | \r\n \r\n -6 \r\n | \r\n \r\n -7 \r\n | \r\n \r\n -8 \r\n | \r\n \r\n - log10\r\n EID50 \r\n | \r\n \r\n NI \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Hthanh\r\n (-) \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n *5/5\r\n \r\n | \r\n \r\n 4/5 \r\n | \r\n \r\n 1/5 \r\n | \r\n \r\n 0/5 \r\n | \r\n \r\n 6.5 \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n Hthanh\r\n (+) \r\n | \r\n \r\n 5/5 \r\n | \r\n \r\n 5/5 \r\n | \r\n \r\n 0/5 \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n 2.5 \r\n | \r\n \r\n 4.0 \r\n | \r\n
\r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
*: số chết/số tiêm.
\r\n\r\n
Chỉ số NI là sự chênh lệch giữa EID50\r\n(hoặc LD50, TCID50)của lô đối chứng (+) và (-)
\r\n\r\n
Chỉ số NI = 4.0
\r\n\r\n
![]()
\r\n\r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
