\r\n\r\n
TIÊU CHUẨN\r\nNGÀNH
\r\n\r\n
10 TCN\r\n819:2006
\r\n\r\n
QUI\r\nTRÌNH PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH STREPTOCOCCUS SUIS
\r\n\r\n
Procedure for\r\nisolation and identification of Streptococcus suis
\r\n\r\n
1.\r\nPhạm vi áp dụng
\r\n\r\n
Qui trình này áp\r\ndụng cho công tác xét nghiệm trong phong thí nghiệm.
\r\n\r\n
2.\r\nKhái niệm
\r\n\r\n
- Streptococcus suis\r\nlà nguyên nhân của nhiều quá trình bệnh lý như viêm màng não, nhiễm trùng huyết\r\ntrong thời kỳ sơ sinh, viêm cuống phổi, viêm khớp và rối loạn sinh sản\r\n(Tarradas C. và CS., 1994)
\r\n\r\n
- Nhiều chủng S.\r\nsuis có khả năng gây bệnh cho lợn. Hai chủng huyết thanh quan trong\r\nlà S. suis typ 1 (nhóm S) và typ 2 (nhóm R),
\r\n\r\n
- S. suis type 1 (S)\r\nthường gây bệnh cho lợn con từ 2 - 4 tuần tuổi
\r\n\r\n
- S. suis type 2\r\n(R) gây bệnh cho lợn từ sau cai sữa cho đến 6 tháng tuổi
\r\n\r\n
- Người làm công tác\r\nthú y, tiếp xúc thường xuyên với lợn hoặc thịt lợn tưoi sống có thể\r\nbị nhiễm S. suis type 2 và mắc bệnh viêm màng não, viêm nội tâm\r\nmạc và nhiễm trùng huyết.
\r\n\r\n
3.\r\nNguyên liệu và dụng cụ
\r\n\r\n
3.1 máy móc
\r\n\r\n
- Tủ ấm 37oC
\r\n\r\n
- Tủ sấy
\r\n\r\n
- Buồng cấy
\r\n\r\n
- Kính hiển vi có vật\r\nkính dầu, vật kính khô hoặc phản pha
\r\n\r\n
- Nồi hấp ướt
\r\n\r\n
- Cân điện
\r\n\r\n
- Tủ lạnh
\r\n\r\n
- Lò vi sóng
\r\n\r\n
3.2 Dụng cụ
\r\n\r\n
- Panh, kéo nhỏ
\r\n\r\n
- Đèn cốn
\r\n\r\n
- Que cấy
\r\n\r\n
- Đĩa petri để đổ môi\r\ntrường
\r\n\r\n
- Lam kính
\r\n\r\n
- Kính lúp
\r\n\r\n
- Lamen (coverslip)
\r\n\r\n
3.3 Môi trường – hoá\r\nchất – Nguyên liệu
\r\n\r\n
- Môi trường chọn\r\nlọc Streptococcus (Edward medium hoặc thạch máu có bổ xung polymicin B và\r\ncrystal violet)
\r\n\r\n
- Môi trường thạch\r\nmáu cừu/bò
\r\n\r\n
- Môi trường đường\r\ninulin, mannitol, raffinose, trehalose,
\r\n\r\n
- Môi trường\r\nVoges- Proskauer (VP)
\r\n\r\n
- Môi trường nước\r\nthịt có 6,5% Nacl.
\r\n\r\n
- Huyết thanh chuẩn\r\nstreptococcus nhóm D (R,S)
\r\n\r\n
![](\"00903951_files/image001.gif\")
\r\n\r\n
1. Lấy mẫu bệnh\r\nphẩm
\r\n\r\n
- Mẫu xét nghiệm\r\nlà hạch amidan, phổi, các phủ tạng, máu (thể nhiễm trùng huyết),\r\ndịch rỉ viêm, dịch khớp và mủ.
\r\n\r\n
2. Soi kính hiển vi
\r\n\r\n
- Mủ và khuẩn lạc\r\nsau khi phân lập được dùng để phết kính nhuộm gram
\r\n\r\n
- Vi khuẩn\r\nstreptococcus suis bắt màu gram (+) có dạng hình cầu hơi dài hoặc hình\r\nquả trứng thường đứng đơn lẻ, xếp đôi, ít khi chuỗi ngắn.
\r\n\r\n
3. Phân lập
\r\n\r\n
- Xử lý vô trùng\r\nphía ngoài (đối với các bệnh phẩm là tổ chức) bằng đốt nóng cán\r\npanh rồi áp vào bề mặt ngoài của tổ chức. Tổ chức ở phía trong\r\nđược dùng cho phân lập vi khuẩn.
\r\n\r\n
- Bệnh phẩm được\r\ncấy lên các loại môi trường thạch máu (bò, ngựa, cừu) và môi trường\r\nchọn lọc (chuẩn bị môi trường xem phụ lục), nuôi cấy ở 37oC,\r\ntrong 24 h
\r\n\r\n
- Khuẩn lạc S. suis\r\nmọc sau thời gian nuôi cấy có dạng nhỏ (khoảng 1-2mm) tròn trơn bóng\r\nláng hoặc nhẵn, thường gây dung huyết alfa hoặc không dung huyêt.
\r\n\r\n
- Các khuẩn lác nghi\r\nS.suis cần phải được giám định
\r\n\r\n
4.\r\nGiám định vi khuẩn
\r\n\r\n
- Để giám định VK S.\r\nsuis có thể dùng 1 trong số những kit thương mại như API 20S, rapid\r\nSTREP (Analytab Products) hay RapID STR system (Innovative Diagnostic System)\r\nvà theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.
\r\n\r\n
Hoặc không, dựa\r\nvào một số tính chất cơ bản sau của streptococcus suis (bảng 1)\r\nđể giám định:
\r\n\r\n
(Các phương pháp\r\nđể kiểm tra các tính chất sinh hoá trên được mô tả trong phần phụ\r\nlục)
\r\n\r\n
Bảng 1: Một số tính chất\r\ncơ bản của Streptococcus suis dùng cho giám định
\r\n\r\n
\r\n \r\n | \r\n Chủng streptococcus \r\n | \r\n \r\n Nhóm huyết thanh \r\n | \r\n \r\n Tính chất dung\r\n huyết \r\n | \r\n \r\n H ình thái khuẩn lạc \r\n | \r\n \r\n Voges- Proskauer \r\n | \r\n \r\n Thuỷ phân aesculin\r\n \r\n | \r\n \r\n inulin \r\n | \r\n \r\n Lactose \r\n | \r\n \r\n Mannitol \r\n | \r\n \r\n Raffinose \r\n | \r\n \r\n Trehalose \r\n | \r\n \r\n Mọc trên 6,5% NaCl \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n S. suis type 1 \r\n | \r\n \r\n D(S) \r\n | \r\n \r\n α, β, KDH \r\n | \r\n \r\n nhỏ, tròn trơn \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n + \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n + \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n S. suis type 2 \r\n | \r\n \r\n D(R) \r\n | \r\n \r\n α, KDH \r\n | \r\n \r\n nhỏ, tròn trơn \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n + \r\n | \r\n \r\n (+) \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n \r\n (+) \r\n | \r\n \r\n + \r\n | \r\n \r\n - \r\n | \r\n
\r\n
\r\n\r\n
* Theo\r\nTarradas C. và cộng sự 1994; Quinn P.L. và Carter G.R., 1994.
\r\n\r\n
5.\r\nĐịnh typ huyết thanh
\r\n\r\n
- Vi khuẩn sau giám\r\nđịnh cần phải được kiểm tra tính chất kháng nguyên theo phân nhóm\r\nLancefield bằng kit thương mại Latex Agglutination test cho S. suis\r\n(Wellcome Diagnostics; Difco laboratories; Scott Laboratories và Diagnostic\r\nProducts Corporation).
\r\n\r\n
6.\r\nTài liệu tham khảo
\r\n\r\n
Quinn P.L. và Carter\r\nG.R. 1994. Veterinary clinical microbiology. USA
\r\n\r\n
Swine disease. 1994, USA.
\r\n\r\n
Cẩm nang chẩn đoán\r\ntiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam. 2002, Viện thú y quốc gia\r\n– JICA.
\r\n\r\n
Sydney M. F. and\r\nEllen J. B. 1986. Bailey Diagnostic and Scott’s Microbiology. Ed 7th.\r\nThe C. V. Moshy Company, Missouri, USA.
\r\n\r\n
Richard F. 2002. What\r\nHappened to the Streptococci: Overview of Taxonomic and Nomenclature Changes. Clinical\r\nMicrobiology Reviews, 15; 4, p. 613-630.
\r\n\r\n
Tarradas C., Arenas\r\nA., Maldonado A., Luque I., Miranda A. and Perea A. 1994. identification of Streptococcus\r\nsuis Isolated from Swine: Proposal for Biochemical Parameters. Journal\r\nof Clinical Microbiology, 32; 2 p. 578-580.
\r\n\r\n
Ashish A. S.,\r\nShreekumar R. P. and Bhushan M. J. 2002. Evaluation of five selective media for\r\nisolation of catalase-negative gram-positive cocci from bulk tank milk. Journal\r\nof dairy science, 85, p 1127-1132.
\r\n\r\n
Gottschalk M.,\r\nHiggins R. ans Boudreau M. 1993. Use of polyvalent coagglutination reagents for\r\nserotyping of streptococcus suis. Journal of Clinical Microbiology. 31;\r\n8, p. 2192-2194.
\r\n\r\n
Florence B. H., Roland C.,\r\nAnnie L., Marcelo G., Jean-Yves C. and Marylene K. 2001. The Canadian\r\njournal of veterinary research. 65, p. 196-200.
\r\n\r\n
Gottschalk M.,\r\nLacouture S. and Odierno L. 1999. Immunomagnetic isolation of streptococcus serotypes\r\n2 and from swine tonsils. Journal of clinical microbiology. 37; 9, p. 2877-2881
\r\n\r\n
\r\n\r\n
\r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n KT. BỘ\r\n TRƯỞNG
\r\n THỨ\r\n TRƯỞNG
\r\n
\r\n
\r\n
\r\n
\r\n Bùi\r\n Bá Bổng \r\n | \r\n
\r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
PHỤ\r\nLỤC
\r\n\r\n
1. Chuẩn bị thạch\r\nmáu
\r\n\r\n
Nguyên liêu:
\r\n\r\n
- Thạch máu cơ\r\nbản/ Blood agar base
\r\n\r\n
- Máu cừu/bò sạch\r\nbệnh
\r\n\r\n
- Nước cất
\r\n\r\n
Chuẩn bị theo\r\nhướng dẫn của nhà sản xuất
\r\n\r\n
- Thạch máu cơ bản\r\nđược hoà với nước cất theo tỉ lệ rồi đun cho tan hết, sau đó hấp ở\r\n121oC 15 phút. Sau khi hấp để nguội đến khoảng 37oC\r\nthi cho thêm 5-7% máu cừu hoặc bò, lắc nhẹ cho đều rồi đổ ra đĩa\r\nPetri.
\r\n\r\n
2. Chuẩn bị môi\r\ntrường chọn lọc
\r\n\r\n
Hiện nay có rât\r\nnhiêu loại môi trường dùng cho phân lập vk Streptococcus tuy nhiên những\r\nloại môi trường sau thường hay được dùng.
\r\n\r\n
a) Edwards modified\r\nmedium
\r\n\r\n
Nguyên liệu:
\r\n\r\n
- Edwards modified\r\nmedium
\r\n\r\n
- Máu cừu/bò
\r\n\r\n
- Colistin
\r\n\r\n
- Oxonlinic acid
\r\n\r\n
- Nước cất
\r\n\r\n
Chuẩn bi
\r\n\r\n
- sau khi chuẩn theo\r\nhướng dẫn của nhà sản xuất có thể bổ xung colistin 5 mg/L and\r\noxonlinic acid 2,5 mg/L and 5% máu cừu/bò để làm tăng khả năng mọc của\r\nvi khuẩn.
\r\n\r\n
Vì trong môi trường\r\nEdward có chứa aesculin nên môi trường này có thể dùng để kiểm tra\r\ntính chât thuỷ phân aesculin của vi khuân có thể nhận biết nếu khuẩn\r\nlạc và môi trường có màu đen (hay dương tính thuỷ phân aesculin)
\r\n\r\n
b) Môi trường thạch\r\nmáu được bổ xung polymyxin B và Crystal violet
\r\n\r\n
- Thạch máu cơ\r\nbản/ Blood agar base
\r\n\r\n
- Máu cừu/bò sạch\r\nbệnh
\r\n\r\n
- Nước cất
\r\n\r\n
- polymyxin B
\r\n\r\n
- Crystal violet
\r\n\r\n
Chuẩn bị
\r\n\r\n
- Môi trường thạch\r\nmáu sau chuẩn bi theo hướng dẫn của nhà sản xuất như đă nói ở phần\r\nchuẩn bị thạch máu được bổ xung thêm polymyxin B 10 mg/L và Crystal\r\nviolet 1mg/L ngay sau khi cho máu vào môi trường.
\r\n\r\n
3. Phương pháp kiểm\r\ntra khả năng sản sinh acetoin trong môi trường VP
\r\n\r\n
Các môi trường và\r\nhoá chất cần có bao gồm:
\r\n\r\n
a) Môi trường VP\r\nthương phẩm, có chứa peptoné, glucose và buffer
\r\n\r\n
Chuẩn bị như sau:
\r\n\r\n
Buffered peptone 7g
\r\n\r\n
Glucose 5g
\r\n\r\n
Dipotasium phosphate 5g
\r\n\r\n
Nước cất 1000ml
\r\n\r\n
b) Thuốc thử A
\r\n\r\n
Alpha naphthol (Sigma\r\nChemical Co.) 5g
\r\n\r\n
Ethyl alcohol (thuần\r\nkhiết) 100ml
\r\n\r\n
Hoà tan Alpha\r\nnaphthol trong một lượng nhỏ Ethyl alcohol rồi đổ thêm cho đủ 100 ml\r\ntrong bình thuỷ tinh tam giác. Giữ trong lọ nâu ở nhiệt độ 4oC
\r\n\r\n
c) Thuốc thử B
\r\n\r\n
Potassium hydroxide\r\n(KOH) 40g
\r\n\r\n
Nước cất 100ml
\r\n\r\n
- KOH phải được pha\r\ntrong bình thuỷ tinh đặt trong nước lạnh để tránh sinh nhiệt. Khi cân\r\nKOH phải cân thật nhanh vì KOH dễ hút ẩm và là chất ăn da khi bị ẩm,\r\nsau đó cho vào bình thuỷ tinh rồi cho một lượng khoảng 90ml nước cất.\r\nSau khi lắc cho tan thì cho thêm 10ml cho đủ lượng. Chất thử này được\r\ngiữ trong bình nhưa ở nhiệt độ 4oC.
\r\n\r\n
d) Phương pháp kiểm\r\ntra:
\r\n\r\n
- Sau khi nuôi cấy\r\nvi khuẩn phân lập được trong môi trường VP ít nhất 48 giờ ở nhiệt độ\r\n37oC lấy 2,5 ml canh trùng cho vào 1 ống nghiệm nhỏ vô trùng.\r\nSau đó cho 0,6 ml (6 giọt) thuốc thử A rồi 0,2 ml (2 giọt) thuốc thử B.\r\nSau khi cho các thuốc thử , lắc nhẹ ống nghiệm rồi để 15 phút đem đọc\r\nkết quả:
\r\n\r\n
- Nếu môi trường\r\ncó màu hồng là phản ứng dương tính, màu vàng hoặc không màu là âm\r\ntính.
\r\n\r\n
4. Phương pháp kiêm\r\ntra khả năng thuỷ phân aesculin
\r\n\r\n
- Có thể dùng môi\r\ntrường Edward để kiểm tra tính chất này như đă nói ở phần chuẩn bị\r\nmôi trường Edward.
\r\n\r\n
- Hoặc có thể\r\ndùng môi trường lỏng có chứa aesculin được chuẩn bị như sau để kiẻm\r\ntra
\r\n\r\n
Aesculin 1g
\r\n\r\n
Peptone water 1000ml
\r\n\r\n
Feric cirtate 0,5 g
\r\n\r\n
Sau khi cho các\r\nthành phần vào với nhau, lắc cho tan rồi hấp ở 115oC trong\r\n10 phút. Giữ ở nhiệt độ 4oC. Nuôi cấy trong môi trường này\r\nở 37oC và theo dõi trong 7 ngày nếu môi trường chuyển từ\r\nmàu nâu sậm sang màu đen là dương tính.
\r\n\r\n
5. Phương pháp kiểm\r\ntra khả năng lên men đường (inulin, lactose, mannitol, raffinose, trehalose).
\r\n\r\n
a) Chuẩn bị môi\r\ntrường
\r\n\r\n
Peptone water 100ml
\r\n\r\n
Chỉ thị màu\r\nandrade 1ml
\r\n\r\n
Sau khi cho các\r\nthành phần vào với nhau, lắc cho đều rồi chia vào các ống nghiệm,\r\nmỗi ống 4 ml.
\r\n\r\n
b) Chỉ thị mau\r\nandrade
\r\n\r\n
Fucsin acid 0,5g
\r\n\r\n
Nước cất 100ml
\r\n\r\n
Dung dịch NaOH-1N 16ml
\r\n\r\n
- Nghiền fucsin\r\ntrong cối sứ nhỏ mịn rồi hoà vào nước cất cho tan hết. Cho vào từ từ\r\ndung dịch NaOH-1N, vừa cho vừa lắc đến khi nào mầu từ đỏ tươi chuyển\r\nthành đỏ nâu, rồi đến khi vàng úa, vàng thẫm thì thôi (lượng NaOH\r\nnhỏ vào thường từ 12-17 ml, trung bình 16 ml là vừa). Để lắng 1-2 giờ\r\nrồi lọc qua giấy lọc. Hấp ướt 120oC trong 15 phút.
\r\n\r\n
c) Dung dịch đường
\r\n\r\n
Trehalose 10g
\r\n\r\n
Nước cất 100ml
\r\n\r\n
Hoà tan Trehalose (inulin,\r\nlactose, mannitol, raffinose) trong nước cất rồi hấp ở 110oC\r\ntrong vòng 20 - 30 phút. Dung dịch đường được giữ ở nhiệt độ 4oC.
\r\n\r\n
d) Phương pháp kiểm\r\ntra:
\r\n\r\n
- Mỗi ống môi\r\ntrường peptone có chỉ thị màu andrade (4ml) được cho 0,3 ml dung dịch\r\nđường. Cấy giống vi khuẩn phân lập được vào môi trường rồi để tủ ấm\r\n37oC sau 24 giờ lấy ra đọc kết quả.
\r\n\r\n
- Nêu môi trường\r\nkhông thay đổi màu. màu vẫn vàng tức là vk không sinh acid, phản ứng\r\nâm tính.
\r\n\r\n
- Nếu môi trường\r\nchuyển từ màu vàng sang đỏ tức là vi khuẩn sinh acid, phản ứng dương\r\ntính
\r\n\r\n
6. Phương pháp kiểm\r\ntra khả năng mọc trên môi trường có 6,5% NaCl
\r\n\r\n
a) Chuẩn bị môi\r\ntrường
\r\n\r\n
Nước Peptone 100ml
\r\n\r\n
NaCl 6,5g
\r\n\r\n
- Cho các thành\r\nphần vào nhau rồi lắc cho tan, chia vào các ống (mỗi ống 5ml) sau đó\r\nhấp ướt ở 110oC trong vòng 20 phút. Cất ở 4oC.
\r\n\r\n
b) Phương pháp kiểm\r\ntra
\r\n\r\n
- Cây vi khuẩn vào\r\nống môi trường để ở 37oC sau 24 giờ đem ria cấy lại trên môi\r\ntrường chọn lọc nếu có vi khuẩn mọc trên môi trường chọn lọc có\r\nnghĩa là vi khuẩn đã sống được trong môi trường có 6,5% NaCl. Ngược\r\nlại vi khuẩn không có khả năng mọc trong môi trường có 6,5% NaCl .
\r\n\r\n
\r\n\r\n
